[发明专利]重组人胞红蛋白复性及其对酒精肝损伤保护的药物用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种重组人胞红蛋白(rhCYGB)表达复性的制备方法及其对酒精肝损伤的保护作用的医药用途，即用于预防或治疗酒精急性肝损伤的用途。

背景技术

2001年，Kawada等首次从TAA诱导的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)中发现了肝星状细胞激活相关蛋白(Stellate cell activation-associated protein，STAP)。STAP与血红蛋白(Hemoglobin，HB)和肌红蛋白(Myoglobin，Mb)结构相似，功能相近，因此STAP现被称胞红蛋白(Cytoglobin，CYGB)。人源CYGB由190个氨基酸残基组成，分子量约为21KD。CYGB是一个较新的蛋白质，现已发现它具有携氧与贮氧、氧感受器和清除自由基等生物学功能。

CYGB具有过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性，其清除自由基抗氧化活性受到生物制药研究者的关注。许瑞安等将大鼠体内通过基因治疗方式给予大鼠CYGB基因后，HSC中过量表达CYGB，可减少细胞外基质合成，预示CYGB具有抗肝纤维化作用。吴梧桐等开展重组人rhCYGB的克隆表达、分离纯化和抗肝纤维化研究，采用CCl₄肝损伤动物模型发现rhCYGB具有抗肝纤维化作用，其研究成果已申请中国发明专利200710020563.7。本项专利申请是在上述专利(200710020563.7)基础上的延续和拓展。

CYGB为六配位体血红素蛋白，蛋白质多肽链形成八段α-螺旋(A-H)和一对二硫键的二级结构，Fe²⁺位于血红素铁卟啉环中心、形成6个配位键，CYGB最终形成类似于肌红蛋白的三维空间结构。CYGB复杂的空间结构和多样性的生物学功能，给大肠杆菌表达制备重组rhCYGB带来挑战。我们在前期研究工作的基础上，改进和优化了分离纯化工艺，发现通过人工添加血红素辅基和采用Sephacryl S-200凝胶层析法纯化，可以提高rhCYGB复性和分离纯化效率。

酒精性肝损伤已成为现代社会的一种富贵病，长期饮酒易引发酒精性脂肪肝，从而导致慢性肝纤维化，并由纤维化直接进入肝硬化。酒精损伤机理是由于酒精能诱导氧自由基产生，导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭，引起肝损伤，并可转化为肝纤维化。本研究采用动物急性酒精肝损伤模型，测试rhCYGB抗酒精性氧化作用，发现rhCYGB在细胞与动物水平对酒精急性肝损伤具有保护作用，这将拓宽rhCYGB的研究与应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种从基因工程菌高效分离纯化重组人胞红蛋白(rhCYGB)的方法。

本发明的第二个目的在于提供一种上述纯化所得重组人胞红蛋白(rhCYGB)在预防和治疗酒精急性肝损伤中的应用。

重组胞红蛋白rhCYGB表达复性制备方法，其步骤如下：

1.pET28a/hCYGB/BL21(DE3)基因工程菌，在最佳表达条件(IPTG 0.1mM至0.5mM，37°C诱导表达6小时至8小时)培养后，离心收获细胞。

2.每克细胞加入10ml裂解液(50mM Tris-Cl，pH8.0，50mM EDTA，1mM PMSF)；细胞经过三步的反复冻融后，再用超声破碎菌体；7000g，30min，4℃离心除去上清，包涵体中加入洗涤液(Tris-Cl，pH 8.0，5mM EDTA，2％去氧胆酸)5ml洗涤，再次离心除去上清。

3.包涵体用2ml(6M盐酸胍，50mM Tris-Cl，pH7.5，50mM DTT)溶液煮沸5分钟。离心(10000g，10分钟，4℃)除去不溶物，得到上清蛋白质溶液，用染料结合比色法测定蛋白溶液浓度。

4.上述所得蛋白质溶液按总蛋白浓度中含有60％rhCYGB计算，加入1.0倍至2.0倍于rhCYGB摩尔浓度的血红素于蛋白质溶液中，轻轻搅拌并静置5分钟至20分钟，离心(10000g，10分钟，4℃)除去不溶物。

5.将离心后的上清液透析(透析液：5mM Tris-Cl，pH8.5)过夜，次日使用聚乙二醇(PEG8000)浓缩至蛋白浓度为2mg/ml。透析复性后的蛋白溶液用Sephacryl-S200柱层析(1.5cmx40cm)进行纯化，层析柱体积约为50ml。上样2ml(2mg/ml)rhCYGB样品后用50mMTris-Cl，pH8.5缓冲液进行洗脱，流速0.8ml/min，紫外检测并分部收集。