[发明专利]一种从骨髓中分离间充质干/祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说是一种分离干细胞的方法，特别是涉及一种从骨髓中分离间充质干/祖细胞的方法。 

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中的非造血干细胞，具备向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力，可分泌大量具有免疫调节、造血支持、促进血管生成、趋化细胞、促进组织损伤修复等生物活性的细胞因子和生长因子。因此，MSC不但是组织工程化骨和软骨构建中重要的种子细胞，而且由于MSC抑制移植物抗宿主反应、促进造血重建和组织损伤修复等功能，在造血细胞移植、治疗组织损伤和缺血性疾病中具有广泛的临床应用前景。 

MSC具有体外贴壁生长特性，利用细胞的贴壁性能，人们已经从人、犬、兔、大鼠、鸡、绵羊、山羊、猪和牛骨髓中，成功分离出MSC。将人或牛等其他动物骨髓细胞体外培养时，贴壁的细胞群体中含有间充质干/祖细胞(mesenchymal stem/progenitor cells，MSPC)、内皮细胞和血细胞。由于培养体系中血清浓度较低，且经过严格筛选，体系中未添加内皮细胞生长因子或其他细胞因子，不利于内皮细胞和血细胞增殖。因此，随着培养传代进行，MSPC成为贴壁层中的主要成分，所占比例在90％以上。 

最近的研究表明，骨髓中还存在其它干细胞，将这类干细胞在不同的实验室和文献中有不同的名称，如多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPC)、骨髓源成体多能诱导细胞(marrowisolated adult multilineage inducible cells，MIAMI)、多能成体干细胞(multipotent adult stem cells，MASC)或小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSEL)。这类干细胞较造血和间充质干细胞更为原始，表现为更为广泛的分化潜能，体外可以向三个胚层的细胞诱导分化，高表达胚胎干细胞分子OCT4、Nanog、SOX2和CXCR4等。这类干细胞在体外培养过程中呈半贴壁状生长，增殖缓慢。在原代MSC培养过程中，一般是将Ficoll或Percoll分选的骨髓单个核细胞培养三天后，通过换液去除未贴壁的血细胞，仅保留贴壁的MSC，所以在这个过程中这类干细胞便被丢弃掉了。如果有一种方法可以将这类干细 胞向MSC诱导分化，相同的骨髓就可获得更多的MSC。 

发明内容

本发明提供了一种实用简单的从骨髓细胞分离间充质干/祖细胞的方法，以提高从骨髓中获得间充质干/祖细胞的数量。 

本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤： 

1)将骨髓细胞用间充质干细胞培养体系进行培养，收集第一次贴壁细胞； 

2)将间充质干细胞培养体系培养的骨髓未贴壁细胞，继续用间充质干细胞培养体系进行二次贴壁培养，去除非贴壁细胞，收集第二次贴壁细胞； 

两次收集的贴壁细胞即为间充质干/祖细胞。 

其中，步骤1)所述骨髓细胞可以是经Ficoll或Percoll分离得到的骨髓单个核细胞，也可以是全骨髓细胞或裂解红细胞后的骨髓细胞；骨髓可以是人的也可以是其它动物的。 

培养时的接种浓度为2-5×10⁴细胞/cm²。 

步骤2)所述未贴壁细胞是指在骨髓细胞培养过程中以悬浮或半贴壁状态存在的细胞；所述未贴壁细胞优选为原代骨髓细胞培养过程中的未贴壁细胞。 

步骤1)和2)所述间充质干细胞培养体系是含有2-10％(体积/体积百分比浓度)胎牛血清或1-5％(体积/体积百分比浓度)人富血小板血清的α-MEM培养基；培养条件为35-38℃、5％CO₂，培养时间为2-3天。 

将第二次贴壁所得到的MSPC细胞用MSC培养体系进行传代培养，细胞体外增殖能力、分化能力和细胞表型与第一次贴壁所得MSC没有明显差别。因此，应用上述两次贴壁法两次获得的贴壁细胞可合并作为本发明方法的产品间充质干/祖细胞，这样，从每份骨髓分离所获得的MSPC细胞数比一次贴壁法多一倍，能更好地满足实验室研究或临床治疗用MSC所需数量。