[发明专利]一株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株分离自油菜叶际的能高效降解有机磷类农药的芽孢杆菌，及其菌剂的生产方法。 

技术背景

有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中的用量最多的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和土壤受到污染。 

利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。有机磷农药降解微生物筛选常用的方法是从长期遭受农药污染的土壤或水体中采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。例如：中国发明专利(申请号：200610090054.7)公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国发明专利(申请号：200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农药污染的土壤中分离获得。 

植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境。在植物的叶际范围内生活着多种微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。对于叶际微生物而言，植物叶际环境相当恶劣，在强烈的日照下，其表面干燥，温度可以达到50℃，紫外线强烈，而夜晚温度又骤降，还有刮风、下雨等天气变化等。对于分离自土壤、污泥等来源的农药降解微生物，不一定能适应植物叶际的恶劣环境，其降解效率往往会受到显著影响。而从植物的叶际分离的农药降解微生物能够在叶际长期生存，比较适应多变的叶际环境，更适合原位降解作物表面的农药残留。 

本专利是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，能够在植物叶际环境下保持良好的降解性能。目前尚未发现从油菜叶际分离出降解有机磷农药的芽孢杆菌 及其菌剂生产方法的文献报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解有机磷农药的叶际微生物菌剂的生产方法。 

本发明采用的降解有机磷农药的菌株是由我们实验室从油菜的叶面上分离筛选出来的。将其编号为N20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年12月3日，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。保藏编号为：CGMCC No.3497，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为GU086424。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与蜡样芽孢杆菌的相似性最高，可以达到99％以上。 

本发明所述的菌剂的生产方法如下： 

1、培养基配制： 

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-7.5； 

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-7.5； 

3)种子培养基(液体，10L)：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5； 

4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，糖蜜12kg，(NH₄)₂SO₄0.8kg，加水至200L，pH 7.0-7.5； 

以上培养基均在121℃灭菌15-30min。 

2、菌种活化：挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；