[发明专利]一种解毒工程菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种解毒工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

现代农业生产为满足人们粮食高产的愿望发挥了巨大的作用，一度被奉为第三世界国家摆脱贫困和饥饿的灵丹妙药，然而面对现代农业中的农副产品品质下降、生物多样性减少，面对农作物病虫害的日益猖獗、农业资源的浪费、农业环境的退化，面对非洲粮食危机的有增无减，人们在欣喜之余，逐渐产生了一种困惑、一种疑虑，开始重新审视现代农业的利弊，重新认识农业资源环境的内涵，重新思考农业科研与决策的方向。

杀虫剂(即农药)的应用是一把双刃剑。一方面，害虫大量的侵食农作物，例如在印度，几乎30％的农作物被害虫侵食，而全球性的食物短缺危机又要求农作物丰产以满足人类的生存需求，因而作为保护农作物所使用的杀虫剂在农业上的应用越来越广泛，占到了世界消耗量的3％。另一方面，杀虫剂的过度使用导致环境受到农药污染，同时造成全球范围的昆虫的杀虫剂抗药性和动物及农作物体内的农药残余。这个矛盾将是未来亟待解决的尖锐问题。

常用的杀虫剂主要有有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类三大类，都会对哺乳动物造成神经毒性。普遍存在于昆虫体内各种组织中的酯酶(Esterase，简称EST)参与酯类杀虫剂的解毒作用，是可以对杀虫剂解毒的重要水解酶之一。不同的水解酶具有各自特定的作用部位，并与之相互作用，将大分子化合物间的键水解掉，使之成为小分子化合物或无毒的离子。现已从微生物细胞内分离得到的磷酸三酯酶是一种细菌的有机磷水解酶(OPH)，可以有效水解有机磷类化合物，显著降低其毒性，但是它不能水解羧酸酯键，因而对于氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的杀虫剂起不到降毒作用。

我国作为一个农业生产大国，更是生产和使用农药的大国。大量使用农药以减轻农产品受病虫害损失的同时，也带来了日益严重的农药残留问题。长期食用高农残的食品，会形成慢性神经性中毒，严重的会引发老年痴呆等病症。由于我国农药使用缺乏规范管理，农产品农药残留普遍超标，导致我国农产品外贸出口遭受重大损失，传统的出口产品，如水果、茶叶和中草药等屡屡发生大批量退货，出口规模严重受制。此外，高农残的蔬菜和水果也会给人的身体健康带来极大的危害，据卫生部门统计，1999年1～10月，共收到食物中毒报告78起，中毒人数4394人，79人死亡，其中由农药引起中毒1108人，死亡59人，超过死亡人数的70％。统计还显示，近年来在食物中毒人数中，由农药残留引起的中毒所占的比例越来越高。

发明内容

本发明的目的是提供一种解毒工程菌及其制备方法和应用。

本发明提供了一种重组质粒，是在质粒pETDuet-1的多克隆位点导入解毒酯酶的编码基因和水解酶的编码基因得到的重组质粒。

所述重组质粒具体可为pETDuet-E4-mpd。pETDuet-E4-mpd是将质粒pETDuet-1中，BamHI和HindIII酶切位点间的小片段替换为解毒酯酶的编码基因，BglII和XhoI酶切位点间的小片段替换为水解酶的编码基因，得到的重组质粒。

所述解毒酯酶可为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有解毒酯酶功能的由序列1衍生的蛋白质；

所述水解酶可为如下(c)或(d)的蛋白质：

(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有水解酶功能的由序列3衍生的蛋白质。

所述解毒酯酶的编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’末端第8至1666位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

所述水解酶的编码基因具体可为如下5)或6)或7)或8)的DNA分子：

5)其编码序列是序列表中序列4自5’末端第11至901位核苷酸所示的DNA分子；

6)序列表中序列4所示的DNA分子；

7)在严格条件下与5)或6)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

8)与5)或6)或7)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。