[发明专利]将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法

权利要求书

1.一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：

(1)在无菌条件下，从健康胎盘组织中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；

(2)清洗上述人羊膜组织；

(3)消化清洗后的人羊膜组织；

(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间 充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml；

其特征在于：

(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液用含有20％FBS的α-MEM的培养基调整到人 羊膜间充质细胞的个数为1×10⁵个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8-12小时细胞贴 壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：5％FBS、 10ng/mlTGF-β1、10ng/mlIGF、0.1μM地塞米松和50ng/ml抗坏血酸，每隔24小时更换 上述培养基一次，诱导21天后，得到骨或软骨细胞，然后种植到24孔板中，贴壁后可用 于甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检测；

(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定或胶原免疫组化检 测，检测得到的细胞是否为骨或软骨细胞。

2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特 征在于：所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊 膜组织。

3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特 征在于：所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4℃的含有100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组 织无任何杂质和血渍后，在温度为20～25℃的无菌间，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml 链霉素的D-hank’s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和100ug/ml 链霉素D-hank’s液中浸泡2小时；2小时后用不含抗生素的D-hank’s液清洗3-5遍。

4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特 征在于：所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白酶的消化 液，放入37℃水浴锅中消化，分两次共消化45分钟，倒掉上述消化液，加入3ml的含 10％FBS的DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’s液消洗直至清洗液 澄清为止。

5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，其特 征在于：所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25％胰蛋白 酶消化液，放入37℃水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新 0.25％胰蛋白酶消化液，放入37℃水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时 每隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化。