[发明专利]将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法

说明书

技术领域

由于人羊膜间充质细胞(human Amnion mesenchymal cells，hAMCs)具有增殖活性和 多分化潜能等干细胞生物学特点，本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或 软骨细胞的方法。

背景技术

股骨头缺血性坏死(AVN avascular necrosis of the femoral head)，又称股骨头无菌性坏 死(ANFH aseptic necrosis of femoral head)或股骨头骨坏死(ONFH osteonecrosis of femoral  head)，是骨科的难治性疾病，在我国应用皮质类固醇(corticosteroid，以下简称激素)和过 量饮酒是引起非创伤性ONFH的主要原因之一。股骨头坏死为进展性致残性疾病，多以关 节塌陷为最终结局，需要进行人工关节置换。目前常用的方法包括：药物(抑制破骨，促 进成骨)，钻孔减压术，自体或异体腓骨移植术，打压植骨术，旋髂动脉移植术，髋臼旋 转截骨术，干细胞移植术等，但是没有一种方法能够有效阻止股骨头塌陷的进程。从理 论上来说干细胞移植术是延缓股骨头塌陷的理想方法，但是由于自体抽取的骨髓基质干细 胞量有限，因而疗效并不确定。而体外培养回植虽然可以获得大量干细胞，但是却存在致 瘤性，很难获得临床应用。除了BMSCs外，也有学者将胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESCs)诱导分化成骨及软骨细胞，但是异体移植后容易形成畸胎瘤和发生免疫排斥反应， 此外，胚胎的应用还涉及法律和伦理学问题，限制了它们在临床中的广泛应用。因此迫切 需要一种既可以分化为成骨细胞和血管内皮细胞，又没有生物安全性问题，而又来源广泛， 没有伦理问题的种子细胞。

由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞抗原 (HLA)--A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细 胞是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和 NK细胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因 子和蛋白酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人 羊膜间充质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等 对同一条件下人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活 性进行比较，发现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于细胞 接触和细胞剂量。

作为一种多潜能细胞，由于间充质干细胞在体内所定居的组织不同，微环境中的细胞 因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进间充质干细胞向不同的谱系分化。人羊膜间 充质细胞可以分化成为软骨细胞，并表达软骨相关基因，如SOX-9、SOX-5、SOX-6、骨 形态蛋白(BMP)-2、-4和BMP受体，在体外应用BMP-2诱导HAM软骨形成后可产生 II型胶原和蛋白聚糖；将HAM和BMP-2植入鼠的非软骨组织内或与胶原支架一起植入 骨缺损处后可见HAM发生了形态改变并伴有II型胶原沉积。

发明内容

本申请的发明目的在于提供一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方 法。

为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成骨或软骨细胞的方法，它包括：

(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；

(2)清洗上述人羊膜组织；

(3)消化清洗后的人羊膜组织；

(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间 充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml；

其中：