[发明专利]一种食源性致病菌的快速鉴定方法

权利要求书

1.用于鉴定四种食源性致病菌的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-AGCAGCCGCGGTAATACG-3’，反向引物序列：5’-Biotin-CGCATTTCACCGCTACAC-3’，测序引物序列：5’-ATTTATTGGGCGTAAAG-3’。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速鉴定四种食源性致病菌的方法，其特征在于按如下步骤：

(1)采用正、反PCR特异引物及Master Mix即用型2X反应缓冲液，加入四种食源性致病菌模板DNA进行PCR扩增；

其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：Master Mix 25μL即用型2X反应缓冲液，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30S，53℃退火30S，72℃延伸30S，循环30次，最后72℃延伸5min，4℃保存；

(2)采用测序特异性引物，对四种食源性致病菌的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；

其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads 3μL，Binding Buffer 47μL(10mmol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol/L测序引物1.2μL，Annealing Buffer 38.8μL。

(3)采用焦磷酸测序仪测序后，直接通过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病菌。

3.利要求1所述的快速鉴定方法，其中的Annealing Buffer的组成是：20mmol/L Tris-AC，2mmol/L MgAc2，pH7.69。

4.利要求1所述的快速鉴定方法，其中四种食源性致病菌指的是：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌。