[发明专利]一种食源性致病菌的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于食品微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌四种食源性致病菌的鉴定方法，特别是一种利用焦磷酸测序技术对四种食源性致病菌快速鉴定方法。

背景技术

据世界卫生组织估计，全世界每年有数以亿计的食源性疾病患者中，70％病源是各种致病性微生物。中国疾病预防控制中心营养与食品安全所近年对我国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的主动监测，结果表明，微生物性食物中毒居首位，占39.62％，化学性食物中毒占38.56％，动植物性和原因不明的食物中毒均在10％左右。

2003年我国重新对致病菌(沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等)检测国家标准进行了修订，但与1994年国家标准相比并没有太大的不同，仍以传统分离培养检测方法为主，该方法除操作繁琐外，检验时间较长，一般需要5～7天培养、生化鉴定时间，已远远不能满足现代检测要求。国外针对致病微生物检测目前主要采用免疫学方法和显色培养基方法以及微生物自动鉴定系统，上述方法共同的优点就是节省一定的鉴定时间，但缺点也非常明显。其中免疫学方法的缺点是：操作技术性要求高，假阴性高，普及困难；显色培养基的缺点是不稳定，贮存时间短，受外界因素影响大；微生物自动鉴定系统，我国目前还未能生产完全自动化的细菌鉴定仪器设备，而且配套试剂也完全依赖进口。

随着生命科学的飞速发展，各种分子生物学实验技术的不断涌现，并逐渐扩展到微生物检验领域。各种以PCR技术为基础的分子生物学检验技术近年来广泛应用于微生物检测，但是这些技术仅能提供阳性扩增产物的片段大小信息，且无法显示特异性的基因序列，假阴性和假阳性无法避免，因此不足以提供确证结论。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单，非常适合用于食源性致病菌快速准确的鉴定。迄今为止，尚未有成功的利用焦磷酸测序技术鉴定沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌四种食源性致病菌的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种食源性致病菌快速鉴定方法及根据四种致病菌16sRNA的保守序列设计PCR特异性扩增引物和测序引物，通过焦磷酸测序结果判定四种食源性致病菌。本发明的检测方法具有高效性、快速、精准及操作简便等特点。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于鉴定四种食源性致病菌的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-AGCAGCCGCGGTAATACG-3’，反向引物序列：5’-Biotin-CGCATTTCACCGCTACAC-3’，测序引物序列：5’-ATTTATTGGGCGTAAAG-3’。每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。

本发明采用PCR扩增及焦磷酸特异性引物快速鉴定四种食源性致病菌的方法，其特征在于按如下步骤：

(1)采用正、反PCR特异引物及Master Mix即用型2X反应缓冲液，加入四种食源性致病菌模板DNA进行PCR扩增；

其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：Master Mix即用型2X反应缓冲液25μL，10μmol/L引物各1μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30S，53℃退火30S，72℃延伸30S，循环30次，最后72℃延伸5min，4℃保存；

(2)采用测序特异性引物，对四种食源性致病菌的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；