[发明专利]进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体指一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法。

背景技术：

蔗扁蛾Opogona sacchari(Bojer，1856)为我国进境植物检疫性有害生物(见2007版的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》)。主要危害巴西木、发财树以及棕搁科植物为主的观赏园林植物和香蕉、甘蔗等传统的经济作物。例如在北京，受害严重的温室每年巴西木的淘汰率达50％以上，造成经济损失高达几百万元。

目前，我国通用的检测鉴定蔗扁蛾的方法仍然是实验室形态学鉴定方法，该法须经饲养、解剖、镜检等繁琐的步骤，其鉴定时间一般至少需要1周。在贸易全球化加速发展的今天，此方法显然已不再适用于当今植物及其产品的进出境检疫，这就迫切要求我们建立一种能快速、准确、高效检测鉴定植物及其产品中是否存在该检疫性有害生物的方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法，是以分子生物学检测方法-PCR法为基础，建立一种针对蔗扁蛾的特异性基因片段进行检测鉴定的方法，可帮助出入境检疫部门、海关等相关单位在口岸进行快速、准确、高效的检测鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法，其特点是：以蔗扁蛾特异性引物CF720/CR1113对待测样品基因组DNA提取液进行PCR扩增，取 PCR扩增液于0.5×TBE电泳缓冲液中在5V/cm电压下电泳后，置于溴化乙锭染色盒中染色，在紫外凝胶成像仪上观察扩增条带，判断该待测样品是否为检疫性有害生物蔗扁蛾；

其中：上述PCR扩增液为PCR反应体系经PCR反应参数后的PCR扩增产物，总反应体系为25μl，各成分组成如下：10×PCR Buffer 2.5μl、各2.5mM的dNTP Mixture 2μl、10pM的蔗扁蛾特异性引物CF720/CR1113各1μl、5U/μl的Taq DNA聚合酶0.13μl、50ng/μl的DNA提取液2μl、灭菌双蒸水16.37μl；PCR反应参数是：94℃预变性4min；94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s共30个循环；72℃延伸5min；最后4℃保存；

上述蔗扁蛾特异性引物为：

正向引物CF720：5‘-ATATATTTTAATTTTACCAGGATTCGGT-3’

反向引物CR1113：5‘-TACTACATAGTAAGTATCGTGGAGAGAT-3’。

本发明的鉴定检测方法的具体步骤如下：

1、待测样品(蔗扁蛾)基因组DNA提取(主要针对新鲜材料，取其足部等)：

1.1.取1克待测样品(蔗扁蛾)肌肉组织(检验检疫现场发现的幼虫、蛹或成虫等样品)于灭菌双蒸水中漂洗，吸水纸吸干，解剖镜下剔除附着物、内容物等杂质，以免其他非样品物质污染。

1.2.将处理后的样品置于1.5ml离心管，加入30μl匀浆缓冲液(STE∶5％SDS∶2mg/ml蛋白酶K＝8∶1∶1)，充分研磨成匀浆后加入匀浆缓冲液补充至600μl，置于37℃水浴1h直至混合液消化变清亮为止。

(注：STE为0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl、0.1mol/L EDTA、PH值为7.0-8.0)

1.3.在混合液中加入等体积的酚氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，上 下缓慢颠倒十次、混匀，12000r/min离心15min取上清液。

1.4.重复前一步骤一次，取上清液。

1.5.加入0.8倍体积的异丙醇置-20℃冰箱中30min，沉淀DNA。

1.6.12000r/min离心15min弃上清液，用无水冰乙醇500μl洗涤沉淀，12000r/min离心15min弃上清液。

1.7.用600μl 75％乙醇重复洗涤一次沉淀，弃上清液。

1.8.自然干燥或55℃温箱干燥约10min，加入50μl TE(或灭菌双蒸水)溶解DNA，用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度后将样品置于-20℃保存备用。

2、样品(蔗扁蛾)基因组DNA浓度、纯度测定：

2.1超微量紫外分光光度计( ND-1000)开机自检。

2.2将2μl的灭菌双蒸水点在检测眼里，将信号接收器归位，点击操作软件，仪器进入检测状态，随后用吸水纸吸干。