[发明专利]大豆锈病菌检测引物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法

权利要求书

1.一种大豆锈病菌检测引物，其特征在于：包括，

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物。

2.一种大豆锈病菌检测试剂盒，其特征在于：包括引物和探针，

所述引物包括：

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物；

所述探针包括：

SEQ ID NO：3：序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’的探针，其中，FAM为荧光分子，MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。

3.如权利要求2所述的用于检测大豆锈病菌的试剂盒，其特征在于：

所述引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix。

4.如权利要求2或3所述的用于检测大豆锈病菌的试剂盒，其特征在于：

所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5μL，所述引物浓度为0.9μM/5μL，所述探针浓度为0.2μM/5μL。

5.一种大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于：依次有以下步骤：待测物中加入引物和探针，2)扩增反应，3)报告检测结果；

所述步骤1)的引物包括：

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物；

所述步骤1)的探针包括：

SEQ ID NO：3：序列为5’FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’，其中，FAM为荧光分子，MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。

6.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤1)加入的引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix，所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5μL，所述引物浓度为0.9μM/5μL，探针浓度为0.2μM/5μL。

7.如权利要求6所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤2)扩增反应是对大豆锈病菌的荧光PCR扩增体系进行扩增反应，所述扩增体系的总体积为10μL，其中所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix体积为5μL，所述引物浓度为0.9μM/5μL，所述探针浓度为0.2μM/5μL，所述待测物为1μL。

8.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤2)中的扩增反应依次有以下子步骤：

2·1)在50℃下持续2分钟；

2·2)在95℃下持续10分钟；

2·3)在95℃下持续15秒；在63℃下持续1分钟，为一个反应区间，重复进行40次。

9.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤3)报告检测结果的判定标准为，如果待测物的报告荧光信号有增加，判定待测物是大豆锈病菌；如果待测物的报告荧光信号没有增加，判定待测物是非大豆锈病菌。

10.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中还包括配置浓度为10-100ng/μL的大豆锈病菌DNA模板；所述步骤2)中还包括在含大豆锈病菌DNA模板的阳性对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中阳性对照组的荧光信号；在不含大豆锈病菌DNA模板的阴性对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中阴性对照组的荧光信号；在空白对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中空白对照组的荧光信号；所述步骤3)为根据阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和待测物的报告荧光信号综合判定报告检测结果。