[发明专利]大豆锈病菌检测引物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明包含酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及一种大豆锈病菌检测引物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。

背景技术

2004年，大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)引发的大豆锈病被美国大豆种植业者列为“头号敌人”首次在美国本土发现，美国农业部海外农业局和动植物检疫局及时将该病害的发生情况通报给我国，要求我国关注该病害。美国农业部所作的风险分析报告认为，如果大豆锈病到达美国，第一年将损失6-13亿美元，如果得不到有效控制，将会对美国的大豆种植业产生重创，因此美国很可能对进口美国的大豆或豆粕采取限制措施，这可能给世界大豆市场尤其是中国的大豆进口和食品安全带来严重影响。

大豆锈病菌主要为害叶片、茎杆和叶柄，感染大豆种子。大豆锈病严重影响大豆的产量，全世界大豆产区的产量因大豆锈病损失可达10％～80％不等，早期发病甚至造成绝收。目前该病在亚洲产区的为害日益猖獗，在南美和北美，也给大豆生产造成了极大威胁。美国发生的大豆锈病与中国本土的未必是同一种，中国是世界头号大豆进口国，我国的大部分地区属于温带气候，尤其是我国沿海各地常年雨量丰沛，气候湿润，非常适合大豆锈病菌的生长，这极大的增加了大豆锈病中一些我国尚未发现的生理小种或新种传入我国的可能性。因此需加强对该病的检疫，防止此病传入、传出是当前保护我国大豆生产和贸易的一个非常重要而又迫切需要解决的新任务，而建立该病菌的快速检测方法是加强口岸检疫的首要前提条件。

国内对大豆锈病的鉴定通常利用它们的冬孢子进行比较，但大豆锈病的冬孢子阶段在田间经常观察不到。此外，早期大豆锈病菌的形态很容易和其它的病害相混淆，我国国内尚未有针对该病害的快速检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌检测引物。

本发明所要解决的另一个技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌检测试剂盒。

本发明所要解决的再一个技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种大豆锈病菌检测引物，包括，

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物。

一种大豆锈病菌检测试剂盒，包括引物和探针，

所述引物包括：

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物；

所述探针包括：

SEQ ID NO：3：序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’的探针，其中，FAM为荧光分子，MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。

本发明的技术问题通过以下进一步的技术方案予以解决：

所述引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix。

优选的技术方案中，

所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5μL，所述引物浓度为0.9μM/5μL，所述探针浓度为0.2μM/5μL。

一种大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，依次有以下步骤：

1)待测物中加入引物和探针，2)扩增反应，3)报告检测结果；

所述步骤1)的引物包括：

SEQ ID NO：1：序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；

SEQ ID NO：2：序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物；

所述步骤1)的探针包括：

SEQ ID NO：3：序列为5’FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’，其中，FAM为荧光分子，MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。

本发明的技术问题通过以下进一步的技术方案予以解决：