[发明专利]基因工程改造六-甲基水杨酸合成酶并组合生物合成螺环乙酰乙酸内酯类抗生素

说明书

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及基因工程改造6-MSA合成酶功能，在 重组菌株组合生物合成新化合物的发酵，分离，结构鉴定，活性测定。

背景技术

天然化合物是药物发现和发展的主要源泉，如抗感染的青霉素和红霉素、抗肿瘤 的博来霉素和埃托霉素、抗寄生虫的阿维菌素和免疫抑制剂环孢菌素等，在过去几十 年里一直是人类治疗疾病的主要药物。所以以天然化合物为基础研制和开发新药一直 是化学界和医药界关注的重点领域。其中微生物来源的天然产物占重要的部分，目前 已报道的微生物天然产物有数千种之多，其中聚酮类和非核糖体聚肽类占了相当大的 比例。

螺环乙酰乙酸内酯抗生素家族是聚酮类天然产物中非常有特色的一类，它们中的 绝大多数是由放线菌产生，具有良好的抗菌活性。其中代表性分子Chlorothricin(CHL， 图1)是一个新型的大环内酯类抗生素，首次分离自菌株Streptomyces antibioticus Tü99，结构特点是由糖苷配基的大环骨架部分含有[6，6]并环和[6，5]螺环(图1)：(1) 反式的十氢萘环，(2)4-羟乙酰乙酸内酯和一个环己烯环形成的螺环(螺环乙酰乙 酸内酯家族天然产物由此得名)，侧链糖基和六甲基水杨酸组成(Helv.Chim.Acta 52 (1969)127-142)。氯丝菌素具有良好的抗感染活性，其抗菌活性归结于对丙酮酸羧 化酶催化的anaplerotic CO₂固定的抑制。进一步的研究表明，CHL与Bacillus subtilis细 胞膜磷脂存在相互作用，具有抗胆固醇的活性。最新研究还表明其具有潜在的抗肿瘤 活性(J.Antibiot.34，1101-1106，J.Antibiot.36，668-670J.Antibiot.44，207-212)。

氯丝菌素独特的化学结构和丰富的生物活性引起了化学、生物和医药界的关注， 如何以之作为先导化合物发展更有价值的临床药物成为各方努力的方向。但是，其复 杂的化学结构为化学合成和结构衍生带来了巨大的挑战，由于过多的手性中心和集中 的官能团，化学合成对于CHL及其类似物的生产前景非常有限，作为有机合成的重要 补充，组合生物合成技术的发展为复杂天然产物及其类似物的获得提供了新方法。通 过对其生物合成基因的克隆，揭示了其包括大环骨架、侧链糖基和六甲基水杨酸等结 构单元在内的生物合成机制(Chemistry&Biology 13，575-585)，在此基础上运用组 合生物合成的原理，合理修饰其生物合成的代谢途径，探索获得所需要的新型的生物 活性提高的结构类似物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的产生活性提高的氯丝菌素类似物的方法，具体 涉及一种对六-甲基水杨酸合成酶的KR结构域的氨基酸残基突变，最终在氯丝菌素 产生菌的重组菌株中产生活性提高的螺环乙酰乙酸内酯类抗生素。

具体如下：

首先用PCR的方法在Streptomyces antibioticus DSM40725中得到编码六-甲基水杨酸 合成酶KR结构域的1.9KbDNA片段，然后连入pSP72的载体中得到含有KR片段 的质粒，下一步从PCR得到的质粒中重切出含有突变位点的KR结构域片段，替代 野生型的6-MSAS的KR结构域一起连入表达载体pTGV2中，然后把此pTGV2衍生 的质粒导入到异源表达模式菌株Streptomyces albus中检测产物。结果1540位的Y突 变成F的重组菌株中产生OSA。上述方法简单易行，只需常规的分子生物学手段， 就可以很快得到功能改变的蛋白，并在异源宿主中检测突变的产物。本发明提供的点 突变蛋白的方法，完全不依赖于任何商业化的突变试剂盒，而是一种简单，廉价，高 效的点突变蛋白的方法。

本发明还提供了一种在Streptomyces antibioticus DSM40725 chlB1基因敲除的突 变菌株中产生两个的新的氯丝菌素类似物的策略和应用。具体方法是我们把上述在 Streptomyces albus中异源表达产生OSA的表达质粒导入到Streptomyces antibioticus DSM40725chlB1基因敲除的突变菌株的中，发酵检测，分离纯化，结构鉴定，初步 的生物活性测定得到了两个活性提高一倍的绿丝菌素的类似物7和8。

附图说明