[发明专利]一种检测土壤精氨酸脱胺酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤精氨酸脱胺酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤精氨酸脱胺酶活性的新方法。

背景技术

土壤中的精氨酸脱胺酶是精氨酸裂解酶的一种，它参与精氨酸的转化循环。精氨酸是一种半必须或条件性必须碱性氨基酸，在精氨酸脱胺酶的作用下水解生成鸟氨酸和尿素，形成的尿素释放在土壤中供植物吸收利用，由此可见，精氨酸是一种重要的氮素贮藏库，它可以利用最小的碳结合最多的氮，是18种必须氨基酸中N/C比例最高的氨基酸。

因此，土壤中精氨酸脱胺酶活性的强弱影响到土壤尿素的氮代谢过程，进而影响氮素的利用效率。土壤中精氨酸脱胺酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同种植作物的影响。因此，对土壤中精氨酸脱胺酶活性的检验有很重要的意义。到目前为止，有关精氨酸脱胺酶活性的测定没有一种准确可靠简便的测定方法，这大大限制了它的应用研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检验土壤中精氨酸脱胺酶活性的分析方法。该方法是在借鉴相关酶活性测定方法的原理基础上，针对土壤精氨酸脱胺酶在氮素转化代谢中的功能特性而进行了方法改进，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测土壤精氨酸脱胺酶活性的方法，

1)分别称取n份5-10g过1-2mm筛的鲜土或预培养土壤样品于150mL三角瓶中，n≥4；向三角瓶中加入2～5mL 10～12mol/L的底物精氨酸溶液，使土壤与底物溶液混合均匀，于三角瓶上塞上不透气的橡皮塞；

将其中n-2个三角瓶于36-38℃培养箱中恒温培养170-190min，作为样品；

余下的2个三角瓶于-19--21℃条件下恒温培养170-190min，作为对照；培养结束后将对照三角瓶在室温条件下解冻；

另取一三角瓶同时作试剂空白对照，即不加土壤，其余同样品处理；

2)分别向上述三角瓶中加入40～60mL 1.5～2mol/L KCI溶液，塞上塞子，振荡55-65min，过滤；

3)分别吸取1～2mL滤液于显色试管中，加入3～5mL 1.5～2mol/L KCI溶液，1～3mL 0.10～0.15mol/L苯酚钠溶液，0.5～2mL次氯酸钠碱性溶液和1～3mL 0.10～0.5mmol/L硝普纳溶液，混合均匀，在室温下显色50-70min，在630nm处以试剂空白对照为比色零点，测定样品和对照的吸光值A；

4)制作工作标准曲线，以铵态氮溶液的标准系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；

5)根据吸光值A和斜率b，计算所测三角瓶中溶液的铵态氮浓度S，S＝A*b；

6)根据三角瓶中溶液的铵态氮浓度S，分别计算样品中铵态氮含量S₁及对照中平均铵态氮含量S₂；

7)计算精氨酸脱胺酶活性

计算公式：(S₁-S₂)/W.T，单位mg NH₄⁺-N/g干土·3h

式中：S₁为样品中的NH₄⁺-N含量(mg)，S₂为二个对照中的平均NH₄⁺-N含量(mg)，W为干土重(g)，T土样培养时间(h)。

显色过程中控制反应体系的pH应为10.5～11.7之间；

若测定吸光值前，待测液中含有干扰的金属离子，可用EDTA螯合剂掩蔽；

掩蔽剂在显色后加入，即在20-30℃时待测液显色50-70min后即可加入掩蔽剂；如过早加入，会使显色反应很慢，蓝色偏低；加入过晚，则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解。

硝普纳作为催化剂，能加速显色，增强蓝色和其稳定性，提高反应灵敏度。在20℃左右室温时一般须放置1h后比色，完全显色约需2～3h；苯酚钠和次氯酸钠试剂不稳定，须存于暗色瓶，存放在4℃冰箱中，用时须温热至室温。