[发明专利]一种诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及诱导细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。

背景技术

WB-F344细胞是一类从Fischer雄鼠肝脏分离出来的细胞，具有许多肝干/祖细胞的特性：1)它具有肝细胞和肝胆管细胞的表型特征；2)当它移植到大鼠的肝脏中后，它能够获得肝细胞的型态和功能特征；3)WB-F344细胞经过化学诱变后移植入大鼠肝脏后能够发展成为胆管癌，表明它具有向胆管细胞分化的潜能，这些特征都说明WB-F344细胞是肝干/祖细胞。有研究发现，丁酸钠处理后的WB-F344细胞具有了胆管细胞的一系列标志，说明WB-F344可在丁酸钠的诱导下向胆管细胞分化。此外，还有研究发现，把WB-F344细胞培养在Matrigel上时，细胞的生长开始停滞，细胞形成管腔样结构，细胞开始收缩并沿管腔结构方向拉伸，细胞的核质比变大。对诱导的细胞进行mRNA和蛋白水平检测发现，胆管细胞的标志如CK19、Yp、aquaporin以及BDS7等的表达量都不同程度的上调。

EPM是哺乳动物中高度保守的一个间质细胞表面膜蛋白，在多种表皮组织(包括肺、肠、肝、乳腺、胰腺、毛囊、胆囊和血管内皮等)的表皮形态发生尤其是腺管结构的形态发生过程中发挥重要作用。有研究发现，在四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型中，EPM的表达量以及EPM阳性细胞的数量随组织修复的时间而发生变化。Watanabe等(Watanabe S，Hirose M，Wang X E，et al.A novel hepatic stellate(Ito)cell-derived protein，epimorphin，plays a key role in the late stages ofliver regeneration[J].Biochem Biophys Res Commun，1998，250(2)：486-490)发现，重组的EPM蛋白对于原代培养的大鼠肝细胞功能的维持也具有重要作用，在普通的培养皿上，原代的大鼠肝细胞只能形成单层的细胞，而在覆盖有EPM蛋白的平皿上可以形成球状聚集体，说明EPM对于肝细胞的三维结构形成以及极性的维持至关重要。随着肝干/祖细胞研究的发展，Nagai等(Nagai H，Terada K，Watanabe G，etal.Differentiation of liver epithelial(stem-like)cells into hepatocytesinduced by coculture with hepatic stellate cells[J].Biochem Biophys ResCommun，2002，293(5)：1420-1425)研究表明，肝星状细胞不仅对于肝实质细胞 功能的维持，而且对肝干/祖细胞向肝细胞分化起到重要的支持作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的用于体外诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化的专用培养基。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基，是在RPMI1640培养基的基础上添加了3％(V/V)胎牛血清，2％(V/V)B27，0.2mol/L L-谷氨酰胺，1％(V/V)青-链霉素。

本发明的第二个目的是提供一种体外诱导肝卵圆细胞定向分化为胆管细胞的方法。

本发明所提供的体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的方法，包括以下步骤：

1)将表皮形态发生蛋白(epimorphin，EPM)基因导入进PT67细胞，得到高表达活性表皮形态发生蛋白的PT67细胞；

2)将高表达活性表皮形态发生蛋白的PT67细胞作为饲养层并进行生长阻滞处理后接种WB-F344细胞，用上述体外诱导肝卵圆细胞分化为胆管细胞的专用培养基在37℃、5％CO2下共培养，促使WB-F344细胞向胆管细胞分化并形成管腔样结构，得到胆管细胞。

在上述诱导方法中，步骤1)中的表皮形态发生蛋白具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，其编码基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。

可按照常规方法将表皮形态发生蛋白基因转染PT67细胞，如通过含有表皮形态发生蛋白基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统或利用脂质体转染法等将表皮形态发生蛋白基因导入PT67细胞。

步骤2)中对高表达活性表皮形态发生蛋白的PT67细胞进行生长阻滞处理的方法为：将贴壁后的高表达活性表皮形态发生蛋白的PT67细胞用浓度为15-20μg/ml的丝裂霉素在37℃、5％CO2下处理细胞1h。