[发明专利]一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白，其特征是该重组表达蛋白为硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白，其中非洲猪瘟病毒VP73基因的核苷酸序列为：

1    ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC

61   TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT

121  GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC

181  AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT

241  ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT

301  TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT

361  CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC

421  GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA

481  TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC

541  GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG

601  GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA

661  ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT

721  TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT

781  GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT

841  CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC

901  GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT

961  AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC

1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA

1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA

1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG

2.一种制备权利要求1所述的硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白的方法，其特征是：

(1)人工合成VP73基因序列；

(2)将VP73基因定向克隆至pET32a原核表达载体；

(3)VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；

将重组表达载体pET32a-VP73转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)7809，进行表达。

(4)VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括：

a.将E.coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有Amp(100μg/ml)的TB液体培养基200ml，37℃，250rpm振荡培养。

b.待其OD₆₀₀达到0.8-1.0，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，转移至30℃，250rpm振荡培养4h，12000rpm，4℃，3min离心收集菌体。

c.将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(360W，30％，5min重复5次)，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。

d.将包涵体沉淀分别用含2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea的PBS洗涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH₂PO₄，10mM咪唑，8mol/L Urea，pH8.0)。

e.包涵体溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合1.5h，用4体积分别含40，60，80，120，150，200，250mmol/L咪唑的漂洗、洗脱缓冲液(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH₂PO₄，8mol/L Urea，pH8.0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗液和洗脱液。12％SDS-PAGE电泳检测后，收集目的蛋白即为纯化蛋白。

(5)表达产物的Western-blot鉴定，主要包括：

a.SDS-PAGE：将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V，40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。

b.转膜：采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。

c.封闭：电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4℃摇床缓慢摇动过夜。

d.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。

e.一抗孵育：将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用1％BSA倍比稀释(1∶3000)，摇床摇动1h。

f.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。

g.二抗孵育：将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用1％BSA倍比稀释(1∶5000)，摇床摇动1h。

h.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。

i.显色：30ml1×AP反应缓冲液buffer，BCIP、NBT各一管混匀，室温暗处缓慢摇动显色。

结果，纯化后的Trx-VP73融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清有特异性反应条带。