[发明专利]靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的制备方法，其特征在于：包 括以下步骤：

a、Osterix基因启动子片段的克隆：根据Osterix基因启动子片段的核苷酸 序列和慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO的引物设计要求设计并合成引物，以小 鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的基因组DNA为模板，PCR扩增Osterix基因启动 子片段，克隆至pGEM-T载体，得重组载体pGEM-T/Osxp；所述引物序列为： 上游引物：5’-ggggtacccccacccagggaagcaagatgat-3’；下游引物：5’-cggaattccggg- tcccaaggagtcaggcagat-3’；

b、Apoptin基因片段的克隆：根据Apoptin基因的核苷酸序列设计并合成引 物，以鸡法氏囊组织中提取的基因组DNA为模板，PCR扩增Apoptin基因片段， 克隆至pGEM-T载体，得重组载体pGEM-T/Apo；所述引物序列为：上游引物： 5’-cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3’；下游引物：5’-gctctagagccagtcttatacgccttcttgc- 3’；自pGEM-T/Apo中用EcoRV和XbaI双酶切出Apoptin基因片段，与同样经 EcoRV和XbaI双酶切的pcDNA3.1(+)载体在T4DNA连接酶的作用下连接，得 重组载体pcDNA3.1-Apo；

c、Osxp-Apoptin重组慢病毒载体的构建：自pGEM-T/Osxp中用KpnI和 EcoRI双酶切出Osxp片段，与同样经KpnI和EcoRI双酶切的pcDNA3.1-Apo 在T4DNA连接酶的作用下连接，得重组载体pcDNA3.1-Osxp-Apo；再自pcDNA3.1- Osxp-Apo中用KpnI和XbaI双酶切出Osxp-Apoptin片段，与pLenti6/V5-D-TOPO 载体连接，得重组载体pLenti6/V5-Osxp-Apo；

d、Osxp-Apoptin重组慢病毒的包装：采用Lipofectamine 2000试剂将 pLenti6/V5-Osxp-Apo以及慢病毒包装质粒混合物共转染293FT细胞，待细胞出 现明显病变后，收集含病毒的培养上清液，即得Osxp-Apoptin重组慢病毒。

2.根据权利要求1所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的制备方 法，其特征在于：步骤a中所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94 ℃变性1分钟、59℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延 伸10分钟。

3.根据权利要求1所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的制备方 法，其特征在于：步骤b中所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94 ℃变性1分钟、60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃ 延伸5分钟。

4.按照权利要求1至3任一项所述的制备方法制得的靶向诱导成骨分化细 胞凋亡的重组慢病毒。

5.权利要求4所述的靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒在制备诱导 成骨分化细胞凋亡的药物中的应用。