[发明专利]靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒，特别涉及一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重 组慢病毒，还涉及该重组慢病毒的制备方法和应用。

背景技术

软骨损伤或缺失是临床上的常见问题，由于软骨的组织学和生物学特性限 制了其自身的修复能力，目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程方法为软骨缺 损的修复提供了一种全新的手段，利用支架材料为种子细胞的增殖和基质分泌 提供空间架构，形成类似正常软骨组织的结构，并行使功能。种子细胞包括胚 胎干细胞和多种来源的间充质干细胞如骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细 胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞等。由于较易 获得和具有诱导成软骨分化潜能，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)被认为是目前软骨组织工程理想的种子细胞。但在将MSCs与可吸收性 支架材料复合构建细胞-材料复合体并进行体外软骨分化诱导培养时，在组织工 程软骨中会有碱性磷酸酶和骨钙素阳性细胞出现，而且，组织工程软骨经裸鼠 皮下种植或者肌袋种植几个月后，在典型的软骨陷窝样结构中散在出现骨化灶， 表明部分种子细胞进入软骨内骨化程序。这种由于种子细胞异质性引起的骨化 现象，是目前制约组织工程软骨构建技术的重要瓶颈问题之一，势必影响到软 骨的构建和在体缺损的完全修复和功能重建。因此，如何调控MSCs定向分化 成软骨细胞并抑制其向成骨细胞分化是目前软骨组织工程学中的重要问题。为 获得高效特异的软骨种子细胞，必须对组织工程软骨种子细胞的成骨分化部分 进行处理。

在成骨细胞的转录调节中，Osterix(Osx，也称为SP7)基因作为成骨细胞 分化和骨形成必需的转录因子日益受到重视。Osterix基因属于Sp/XKLF家族， 是一种具有锌指基序结构域的转录因子，位于核心结合因子Cbfa1/Runx2的下游 并受其调控，在Osterix基因启动子区(-713～-700bp)存在Cbfa1的识别调控位 点。研究发现，Osterix基因敲除小鼠无骨骼形成但具有软骨内骨骼结构，且Cbfa1 表达为阳性，而Cbfa1缺陷小鼠不表达Osterix。据此，部分学者提出了成骨细 胞分化形成的模式：MSCs分化为能分泌II型胶原的软骨前体细胞→Cbfa1基因 启动→细胞向能分泌I型胶原的成骨前体细胞或肥大型软骨细胞转化→Osterix 基因启动→成骨前体细胞转化为成骨细胞→成骨细胞分泌骨钙素、骨唾液蛋白 及骨连接蛋白等细胞外基质。根据上述模式，表达Cbfa1的细胞仍有潜在双向 分化能力，既可分化为成骨细胞，又可分化为软骨细胞，而表达Osterix的细胞 具有直接成骨能力。

凋亡素(Apoptin)是一种来源于鸡贫血病毒、由121个氨基酸组成的小蛋 白，能诱导雏鸡造血母细胞和T淋巴细胞前体细胞凋亡，导致雏鸡出现严重的 贫血和免疫机能低下。Apoptin还可以通过独立于p53作用途径且不被Bcl-2过 量表达所抑制的方式诱导人肿瘤细胞和转化细胞凋亡，而对正常细胞不发挥作 用。因此，Apoptin被认为是第一个真正意义上可选择性诱导肿瘤细胞和转化细 胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。研究发现，Apoptin诱导细胞凋亡活性与 其亚细胞定位密切相关。在正常细胞中，Apoptin定位于细胞质，不能诱导细胞 凋亡；而在肿瘤细胞中，Apoptin定位于细胞核中，能够诱导肿瘤细胞凋亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的 重组慢病毒，可以对经过成软骨诱导分化处理的种子细胞中残存的成骨分化细 胞进行处理，诱导成骨分化细胞凋亡而对成软骨分化细胞和正常软骨细胞不发 挥作用，保证种子细胞成软骨分化的单一路径，从而为组织工程软骨的构建提 供一种良好的种子细胞；目的之二在于提供所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的 重组慢病毒的制备方法；目的之三在于提供所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的 重组慢病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒，所述重组慢病毒基因组中包 含一个Apoptin基因表达盒，所述Apoptin基因表达盒包含Osterix基因启动子、 Apoptin基因和终止子，所述Apoptin基因的表达由Osterix基因启动子调控。

进一步，所述Apoptin基因表达盒还包括V5表位基因序列，所述V5表位 基因序列位于Apoptin基因和终止子之间；