[发明专利]VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病 毒基因组中包含一个VSIG4和IGRP双基因表达盒，所述VSIG4和IGRP双基 因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、VSIG4全长编码基因、终止子、 内部核糖体进入位点IRES、IGRP全长编码基因和终止子。

2.权利要求1所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法， 其特征在于：包括以下步骤：

a、RT-PCR扩增VSIG4全长cDNA；

b、RT-PCR扩增IGRP全长cDNA；

c、将步骤a所得VSIG4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b 所得IGRP全长cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-VSIG4- IRES-IGRP；

d、以步骤c所得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP为模板，PCR扩增 VSIG4-IRES-IGRP片段并更换该片段两端的酶切位点；

e、将步骤d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV 的CMV启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP；

f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP与 腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行胞内同源重组，得重组腺 病毒载体pAd-VSIG4/IGRP；

g、将重组腺病毒载体pAd-VSIG4/IGRP在293细胞中包装成重组腺病毒 Ad-VSIG4/IGRP。

3.根据权利要求2所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备 方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肺组织总RNA，逆转录得到 总cDNA，再以巢式PCR扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以所得总cDNA 为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物；第二轮PCR 以第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游 引物；每轮PCR的循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒， 58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR 产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-VSIG4。

4.根据权利要求3所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备 方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得 到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示序列 为上下游引物，PCR扩增IGRP全长cDNA，PCR循环条件参数为：94℃预变性 5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环； 最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体 pT-IGRP。

5.根据权利要求4所述的VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备 方法，其特征在于：步骤c的具体方法为：自重组载体pT-VSIG4中用Pst I和 EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切 的pStar载体连接，得重组载体pStar-VSIG4；再自pT-IGRP载体中用BamH I 和SalI双酶切出IGRP全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和SalI双酶切 的pStar-VSIG4载体连接，得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP。