[发明专利]VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，特别涉及一种VSIG4和IGRP双基因共表达 重组腺病毒，还涉及该重组腺病毒的制备方法和应用。

背景技术

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，由于身体的免疫系统攻击胰岛β细胞破 坏其分泌胰岛素的能力而引起。目前主要依赖胰岛素和胰岛移植进行治疗，虽 然能够降低患者的死亡率，却存在着大量副作用。随着研究的深入，实验发现T 细胞在免疫系统介导的1型糖尿病的发病过程中发挥了重要作用，特异性诱导T 细胞介导的免疫耐受对1型糖尿病是一种很有希望的治疗策略。

在T细胞介导的免疫应答中，T细胞的活化不仅需要抗原肽与主要组织相容 性复合体(MHC)的复合刺激，而且需要B7家族成员提供关键的共刺激信号。 含V-set和免疫球蛋白域4(V-set and Ig domain containing 4，VSIG4)又称补体受 体免疫球蛋白超家族分子(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily， CRIg)，是一种新发现的B7家族相关蛋白。VSIG4的mRNA高表达于成人肺、胎 盘、肝和心脏等组织，但VSIG4主要局限表达于巨噬细胞，在单核细胞中几乎没 有表达，并且当巨噬细胞受外来刺激活化后VSIG4表达下调。既往研究发现， VSIG4是巨噬细胞上的补体受体，可结合补体C3的降解片段C3b和iC3b，对于病 原体的吞噬起重要作用。最近研究显示，VSIG4有抑制T细胞活化的作用，且作 用强于PD-Ls/PD-1途径，是一个有力的T细胞活化负调节分子。

葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)是一种胰岛特异性T细胞自身 抗原，在1型糖尿病的发病过程中起着非常关键的作用，患者体内有大量的IGRP 特异性T细胞存在。因此，在1型糖尿病的治疗中，IGRP有可能成为诱导免疫耐 受的重要分子。

基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表 达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需 要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多； 此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问 题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上 述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载 体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调 控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服 了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。

树突状细胞不仅是机体内功能最强大的抗原递呈细胞，可以有效激活初始T 细胞启动免疫应答反应，而且树突状细胞本身具有调节免疫反应、诱导免疫耐 受的作用。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染树突状细胞制成 树突状细胞疫苗，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种VSIG4和IGRP双基因共表达 重组腺病毒，能够有效诱导特异性T细胞耐受，并有效抑制胰岛β细胞的破坏； 目的之二在于提供所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法； 目的之三在于提供所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒，所述重组腺病毒基因组中包 含一个VSIG4和IGRP双基因表达盒，所述VSIG4和IGRP双基因表达盒由上 游至下游依次包含CMV启动子、VSIG4全长编码基因、终止子、内部核糖体进 入位点IRES、IGRP全长编码基因和终止子。

2、所述VSIG4和IGRP双基因共表达重组腺病毒的制备方法，包括以下步 骤：

a、RT-PCR扩增VSIG4全长cDNA；

b、RT-PCR扩增IGRP全长cDNA；

c、将步骤a所得VSIG4全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b 所得IGRP全长cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-VSIG4- IRES-IGRP；

d、以步骤c所得重组载体pStar-VSIG4-IRES-IGRP为模板，PCR扩增 VSIG4-IRES-IGRP片段并更换该片段两端的酶切位点；