[发明专利]磁性微粒大量提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳微米材料的应用领域，具体涉及到分子生物学中，利用磁性微粒从生物样品中快速抽提纯化大量基因组DNA。

背景技术

核酸提取是许多分子生物学技术中的关键步骤，由于对纯度、完整性等要求，其提取方法尤为重要。目前，提取DNA的方法多种各样。传统的酚-氯仿液相抽提法，操作繁琐费时，使用溶液具有毒性；而新的固相提取法，较之操作简便，无毒环保。

关于核酸的固相提取法，已报道的方法包括利用硅表面、玻璃、离子交换树脂或者经过修饰的磁珠等特异的吸附DNA。其中，中国专利CN 12430100、CN 101033484A、CN 1706959A、CN 101165182，需要使用离心机等大型仪器，提取过程长；CN 101173274A采用滤器，滤膜等耗材，成本较高。

已有文献报道资料(如：核壳型磁性纳米微球的制备及在核酸提取中的应用，现代生物医学进展，2009，9：470-474)，所提取血液的样品量都在200μl以下。已有的核酸自动提取仪，如欧达科仪MP-120，处理样品容量在20～200μl，百维信Lab-Aid 800处理样品容量在100～1000μl，圆点奈米TANBeadSLA-16/SLA-32容量最大为1000μl。通常情况下，纯化50～500μl全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大，但是当从大量样品(如1～10ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题，而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在同样的问题。

发明内容

为了解决背景技术中的上述问题，本发明提供了一种基于具有磁性微粒的核酸纯化技术，可用于从大量样品(包括全血或组织)中提取高纯度DNA的方法，以满足临床诊断、法医学、生命科学及各项研究中的对全基因组的大量需求，该方法不需大型仪器，成本低。

本发明的技术方案：

磁性微粒从生物样本中提取大量DNA的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

(1)裂解细胞：取1～10ml血液样品(或100～1000mg组织样品)，加入100～5000μl蛋白酶K溶液和1～20ml浓度为4～6M的盐酸胍裂解液，混匀后于20～70℃水浴中充分裂解5～20min；

(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液：取0.4～6mg经结合液预处理过的磁性微粒，加入到裂解后的细胞液中，振荡混匀，于室温充分结合，形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液；

(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离：将混合溶液磁性分离，弃去上清，将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来，收集；

(4)清洗：用2～40ml清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物，去除蛋白和其他杂质。

(5)洗脱：在磁性微粒-DNA复合物中加入0.5～5ml洗脱液，让DNA从磁性微粒上洗脱下来，在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离，收集上清，上清即为纯化的DNA。

一般情况下，磁性纳米微球用于核酸提取中，每次提取的最佳样品量都在200μl左右。通常，纯化50μl～500μl人全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大，但是当从大量(＞1ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题，而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在这样的问题。上述方法通过选用优化的试剂和试剂配比，满足了从1～10ml的血液样本和100～1000mg组织样本中成功提取高纯度的DNA。

上述步骤(1)的血液样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的体积比为5∶1∶10时，裂解效果最好；上述步骤(1)的组织样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的比例为：每100mg组织样品加入200μl蛋白酶K和2ml裂解液。蛋白酶K溶液与盐酸胍裂解液量过少，裂解不充分；量过高，成本上升，对裂解效果无显著影响。

上述步骤(1)盐酸胍裂解液的成分是：3～4M GuHCl，0.01～0.02M EDTA，0.01～0.02M NaCl和4～6％TX-100。

步骤(1)水浴反应温度为56℃时效果最好。温度过低，造成蛋白酶K的活性降低；温度过高，酶因变性而失去活性。该体系在选用56℃为裂解温度时，酶的消化作用最强。

上述步骤(4)所用的清洗液可以用乙醇、异丙醇或者异戊醇。

上述步骤(5)所用的洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH＝8.0的TE溶液，也可以用水来洗脱。