[发明专利]一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于对目的细胞分选的方法。

背景技术

随着生命科学的不断发展，细胞生物学和免疫学基础研究以及临床疾病的诊断都需要从含有不同细胞的混合样本中分离出纯化细胞，现有的细胞分离技术主要有：Ficoll密度梯度离心，离心洗涤，双水相分离，这些方法都是利用细胞大小，密度，表面电荷等物理性质的特征加以分离，其缺点是难以获得理想纯度及回收率，而流式细胞仪分选虽然能获得很高的纯度和回收率却需要昂贵的仪器，且操作过程复杂费时。而磁性复合微粒用于细胞分选是近些年来迅速发展起来的一项细胞分离的技术，就是将结合有抗体的磁性复合微粒在混合细胞体系中利用抗体与细胞表面标志物特异的结合，在外加磁场的作用下，将要分离的目的细胞分离。但是目前的磁性复合微粒用于细胞分选也存在一些问题譬如，磁性复合微粒存在对目的抗体外的蛋白的非特异性吸附，或者抗体结合量少等缺点，造成细胞分选中分选的目的细胞纯度和效率低。

发明内容

本发明的目的

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种利用亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于对目的细胞分选的方法，该方法简单迅速，不需昂贵的仪器，成本低，并且对所结合细胞毒性小，不易使之失活；分选出的目的细胞纯度高，并能够用于后续培养。

本发明的技术方案

本发明提供的一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于细胞分选的方法，包括以下步骤：

(1)亲和素/链亲和素磁性复合微粒的预处理

将亲和素/链亲和素磁性复合微粒分散于平衡盐溶液中，磁性分离，弃上清；亲和素/链亲和素磁性复合微粒预处理三次为宜。

(2)封闭

向步骤(1)产物中加入封闭剂，反应20-120分钟，再用pH＝7.4，0.02M的磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液或醋酸盐缓冲液。

(3)生物素化抗体与细胞的抚育

取待分选的样本细胞，加入生物素抗体，室温反应10-60分钟，再以800rpm-1500rpm的转速离心5～10分钟，弃去上清中未结合的生物素抗体，将样本细胞重悬在偶联缓冲液中；

(4)细胞分选

(4.1)目标细胞和亲和素/链亲和素磁性复合微粒的结合

将步骤(3)得到的结合有生物素抗体的待分选的样本细胞与经步骤(2)封闭处理后的亲和素/链亲和素磁性复合微粒混合，在20℃-35℃下孵育10-60分钟，间隔5-10分钟轻轻晃动反应管，避免磁粒的沉淀，使生物素与亲和素或者链亲和素充分的结合而将要分离的目的细胞固定在亲和素/链亲和素磁性复合微粒的表面；

(4.2)清洗

将步骤(4.1)的反应产物磁性分离，弃上清，加入清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，洗去未结合的细胞。

上述步骤(1)平衡盐溶液可选自pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、pH＝7.0-7.6，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐溶液HEPES的一种，或者是加入了0.1-1.0M NaCl的上述溶液中的一种。

上述步骤(2)封闭剂可选自浓度为1-10％的脱脂奶粉、1-5％的BSA、0.2-2.0％明胶中的一种。

上述步骤(3)偶联缓冲液可选自pH＝7.0-9.0，5mM-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液Tris-HCl、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液CBS、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液中的一种。

上述步骤(4.2)清洗缓冲液可选自pH＝7.0-9.0，5mM-1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液Tris-HCl、pH＝5.0-8，0.02-0.2M的磷酸缓冲液PBS、pH＝9.0-11.0，5mM-1M的碳酸盐缓冲液CBS、pH＝3.6-5.6，5mM-1M的醋酸盐缓冲液、pH＝3.0-7.0，5mM-1M的柠檬酸缓冲液或pH＝7.0-9.0，5mM-1M的TE缓冲液中的一种或者是含有0.02-0.2％吐温的上述缓冲液中的一种。

上述样本细胞可以是外周血，骨髓，脐带血和淋巴组织液中的细胞。