[发明专利]微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是发酵正十一烷(以下简称nC₁₁)高产α，ω-十一碳二羧酸(以下简称DC₁₁)的方法。

背景技术：

C₁₀以上的长链二元酸是化工上合成高级香料、高级尼龙工程塑料、高档服装用尼龙热熔胶、高温电解质、高级涂料、润滑油和耐寒性增塑剂等的重要原料，尤其是十三碳二元酸(DC₁₃)和十五碳二元酸(DC₁₅)，它们分别是合成日用香料麝香-T和名贵香料麝香酮的重要原料。

C₁₀以上的长链二元酸，在自然界中不单独存在，只有少数几种二元酸可以从植物油中裂解制取，例如癸二酸(DC₁₀)可从蓖麻籽油裂解制取；DC₁₃可从菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生产；DC₁₅可从蒜头果油中的脑神经酸裂解制取。但它们都受农田和气候的限制，远不能满足需要。除DC₁₂以外，化工上至今也还没有经济可行的合成路线和方法。微生物学家应用生物工程技术，利用微生物发酵石油中的正构烷烃生产相应链长的二元酸，弥补了化工上的不足，开辟了长链二元酸的新来源。

七十年代以前，各国科学家对微生物发酵生产二元酸的研究，只处于理论研究阶段，所产生和积累的二元酸也都是十个碳以下的短链二元酸，七十年代以后，进入应用研究阶段，通过大量的菌种诱变筛选，培育出一批新突变菌株，能从十个碳以上的正烷烃产生和积累与基质链长相同的长链二元酸，并通过不断的培育和代谢调控研究，使每升发酵液中二元酸的积累从开始时的几克、十几克、几十克，提高到目前的一百多克。八十年代以来，二元酸的研究进入小规模工业化生产阶段，并出现了几个有实际生产价值的文献。

十一碳二元酸(DC₁₁)是化工上合成尼龙工程塑料、润滑油和农药等的重要原料。至今国内外还没有经济可行的化工合成方法。用生物合成法合成生产DC₁₁的报道不多。目前报道的最好的十一碳二元酸的发酵生产结果为：在200m³发酵罐中，发酵时间165小时，发酵液中DC₁₁含量为120.4g/L，烷烃转化率为64.55％。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的微生物菌种，以及利用该微生物菌种同步发酵正烷烃生产C₁₀-C₁₈长链α，ω-二元酸的方法，尤其是同步发酵正十一烷烃，高产α，ω-十一碳二元酸的方法。

本发明所提供的菌种为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母【参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980】为出发菌株，通过紫外线照射诱变、筛选培育出来的，具体步骤如下：

接一接种环上述热带假丝酵母菌体，装于25ml麦芽汁液体培养15小时，分别取3ml种液放入灭过菌并带有一个玻璃磁转子的培养皿中，打开培养皿盖，在24W的紫外线灯下16cm处照射1min、2min、3min、4min，不同照射剂量的菌液稀释10^-1，在黑暗处放置2小时，用生理盐水分别稀释菌液10^-4-10^-6，吸取稀释好的菌液0.1m涂布于10个巴林糖度的麦芽汁琼脂培养平板上，每个稀释度涂布3个平板。将涂好的平皿用黑纸包好，置于28℃的培养箱中培养2天，统计致死率。

菌种筛选：以出发菌株为对照，对诱变后的菌株进行发酵产酸试验及产酸量检测，筛选出高产α，ω-十一碳二羧酸的菌株，即为热带假丝酵母(Candidatropicalis)ly-1，该菌种能以C₁₀-C₁₈的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十一烷为基质原料，发酵生产出相应的长链二羧酸。

本发明热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1已于2009年10月14日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 209223。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-1的生理特性如下：

糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，