[发明专利]牛型结核菌素组分及活性的高效液相测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测提纯牛型结核菌素(PPD)中的结核蛋白和核酸相对含量，以及 牛结核菌素活性的高效液相测定方法。属于兽用生物制品领域的色谱法效价测定技术。

背景技术

牛结核病是牛结核分枝杆菌引起的动物和人的一种慢性细菌性疾病，是一种人畜共患 致病微生物。牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种传染病，其特征是形成结节状肉芽肿， 称为结核。

提纯牛型结核菌素为牛结核分枝杆菌菌株经液体表面培养、蒸汽杀菌过滤除去菌体， 用沉淀分离、洗涤及再溶解的提纯方法制成的液体或冻干制品，含有从结核杆菌培养滤液 中获得的活性物质，其主要成分是结核蛋白，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的机 体，能引起特异的皮肤变态反应。

PPD中有效成分为结核蛋白，另外还带有少量核酸和多糖。在国际兽医卫生组织(OIE) 和我国农业部颁布的“结核菌素制造及检验规程”中均用生物学方法，即用豚鼠来标定提 纯牛型结核菌素的活性，该方法能反映结核菌素的临床活性作用，但缺点是测定繁琐，影 响因素较多，平行性不好，测定专属性不强，数据不直观等，结核蛋白和核酸的相对含量 无法直接确定。

发明内容

本发明的目的是提供一种直接测定提纯牛型结核菌素中的结核蛋白和核酸相对含量， 以及牛结核菌素活性的高效液相测定方法。

本发明利用色谱分离的原理，将提纯牛型结核菌素溶液稀释后注入液相色谱系统中， 利用色谱柱对结核蛋白和核酸的吸附能力的不同和流动相的分离作用，达到将两种成分进 行分离的目的。由于结核蛋白和核酸在紫外区均有吸收，可用紫外检测器分别测定各组分 色谱峰的峰面积，根据峰面积归一化法计算得提纯牛型结核菌素中结核蛋白和核酸的相对 含量；因为只有结核蛋白才具有生物活性，因此同时用国际牛型提纯结核菌素标准品作外 标标准品进行测定，用外标法根据结核蛋白的峰面积计算得提纯牛结核菌素中结核蛋白的 效价(活性)。

本发明的详细描述：

取提纯牛型结核菌素溶液，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.9万IU(国际单 位)的溶液，精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取提纯牛型结核菌素国际 标准品，同法测定。色谱柱以5μm，300的聚苯乙烯/二乙烯苯树脂颗粒作为填充剂，流 动相为乙腈-水-三氟乙酸(25∶75∶0.1)，检测器为紫外检测器，检测波长为271nm，流速 为1.0mL/分。

根据液相色谱图中结核蛋白和核酸的峰面积，按峰面积归一化法计算结核蛋白和核酸 的相对含量；根据标准品和供试品色谱图中结核蛋白的峰面积，按外标法计算牛型提纯结 核菌素的效价。

本发明提供的方法包括色谱柱、色谱条件、测定方法、相对含量和效价(活性)的确 定方法。

所述色谱柱用5μm，300的聚苯乙烯/二乙烯苯树脂颗粒作为填料，此树脂经过特殊 的处理，有着特殊的反相特性，较强的强度，承受较高的压力。所述色谱柱有着优异的反 相吸附性，能够耐受强酸和强碱，pH适用范围0～14。由于聚苯乙烯/二乙烯苯树脂具有 反相吸附作用，对于结核蛋白具有吸附作用，而核酸因为具有较强的酸性，离子化程度较 大，所以相对来说树脂对它吸附作用较小，这样能有很好的分离，而且由于核酸在该柱上 保留较弱，很快出峰，峰形对称且尖锐；而该柱对于结核蛋白的柱效很高，因而结核蛋白 的峰形也很好。

所述色谱条件中，流动相为乙腈-水-三氟乙酸(25∶75∶0.1)，检测器为紫外检测器， 检测波长为271nm，流速为1.0mL/min。

所述测定方法为取提纯牛型结核菌素，用水溶解并稀释成每1mL中约含0.9万IU的 溶液，精密量取10μL，注入色谱仪，记录色谱图。

结核蛋白和核酸的相对含量的计算方法为峰面积归一化法，所述牛结核菌素活性的测 定方法为外标法(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版一部.中国 农业出版社，2005)。

效价测定的线性

取已知效价的PPD，用灭菌水稀释成0.4、0.7、0.9和1.1万IU/ml的溶液，按HPLC 测定法进行测定，得线性关系为y＝2×10⁶x-6783.6，R＝1.000。见图2

附图说明