[发明专利]牛型结核菌素标准物质及其制备方法

权利要求书

1.一种制备牛型结核菌素标准物质的方法，其特征在于制备步骤如下：

（1）培养基

载于“农业部兽用生物制品规程委员会，中华人民共和国兽用生物制 品规程，2000年版，化学工业出版社,2000”中的苏通合成培养基，成 分包括如下，天门冬素4g、柠檬酸2g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.5g 、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60ml，每种成分均为分析纯，加蒸馏水940 ml，共制备50000ml；

（2）菌种

中国兽医药品监察所提供的牛分枝杆菌C68001和C68002株；

生产用种子制备

1）一级种子制备

接种  将冻干菌种开封后，接种小川培养基置37℃温室中培养两周 ，发育生长呈黄色颗粒状菌落或菌苔，为一级种子；

2）二级种子制备

用铂金铲钩取一级种子菌苔或菌落，均匀涂布于数支小川培养基斜面 上，置37℃温室中培养10天，即可发育良好，此培养物用作液体驯化 ；

为使生长在固体培养基上的结核菌种能在液体培养基中生长繁殖，以 适应结核菌素生产的需要，应于生长前期将菌种接种于液体培养基上 ，进行种子驯化工作；用铂金铲从小川培养基斜面上钩取菌苔，在苏 通合成培养基试管内壁充分研细，然后倾斜试管，用培养基轻轻接触 菌体，使其浮在培养基液面上，缓慢移至37℃温室中培养7～15日，则 在培养基表面形成薄的菌膜；用铂金环挑出一块菌膜移植到苏通合成 培养基瓶中，在37℃温室中培养7～15日，即可在培养瓶液体表面形成 具有弹性的菌膜，再菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37℃温室中 培养7～15日，在球瓶液体表面上形成微有皱褶、弹性较强的菌膜，此 菌膜即可作为大量生产的种子，为二级种子；

3）二级种子鉴定

肉眼观察，液体必须清亮，菌膜纯粹、薄白、无杂菌污染，对于液体 不清亮的培养物弃去；

（3）菌素制造

1）接种  挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，轻轻放 回原处，

接种完毕后，应对已接种的培养基瓶逐瓶进行检查，发现有种子下沉 或散开者进行再接种，接种结束后，小心移入温室中，轻放于培养架 上；

2）培养  培养期间须定期检查温度、湿度和有无杂菌生长，污染者 及时高压灭菌弃去；

3）灭活  培养2～3个月，菌膜生长较厚，停止培养，培养物置121 ℃灭活30min；

4）混合粗滤  首先用双层纱布加一层铜纱将两个菌株同一批号相同 瓶数的培养瓶培养物混合滤过除去菌膜；

5）细滤 在滤器中加入8块甲3滤板，打开空气压缩机电源使纯化水完 全通过滤器；将混合菌液吸入储料罐，再使之完全通过滤器，即为结 核菌素滤液， 40000ml；

6）提纯 将附录中1倍体积的40%三氯醋酸溶液徐徐加入到9倍体积的 结核菌素滤液中，边加边搅拌，混匀后，在2～8℃静置14-24小时，使 蛋白沉淀；然后小心将上清吸出，收集沉淀；用附录中1%三氯醋酸溶 液将沉淀物重新悬浮混匀，再经4000r/min，2～8℃，30min离心沉淀 去上清，如此3次，最后一次离心结束后，弃上清称重，并减去离心管 重量得到湿蛋白净重， 70g；

重溶过滤  将沉淀物先加附录中的1mol/L氢氧化钠溶液约7ml，使之 溶解；根据湿蛋白净重和适当的稀释倍数计算出稀释后菌素总体积和 需要附录中pH7.4磷酸盐缓冲液的体积；先量取少量pH7.4磷酸盐缓冲 液将离心管内菌素浓缩液进行稀释，并用量筒转移至3000ml瓶，再用 剩余体积的pH 7.4磷酸盐缓冲液对离心管和量筒进行2次洗涤并先后 转移至3000ml瓶，此即为单批的提纯牛型结核菌素原液；将提纯牛型 结核菌素原液进行适当稀释，调pH到7.4，用灭菌赛氏滤器过滤即为候 选物；

（4） 候选物检定

1）无菌检验

按2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录448页进行；

2） 蛋白含量测定

取少量无菌检验合格的提纯牛型结核菌素半成品，采用按《中华人民 共和国兽药典》2000年版一部附录44页记载的凯氏定氮法测定每1ml总 氮量，计算蛋白含量，具体操作步骤参见，附《牛型提纯结核菌素国 家标准品蛋白质含量测定标准操作方法》根据蛋白含量测定结果，用 苯酚含量为0.5%（W/V）pH7.4磷酸盐缓冲液将提纯牛型结核菌素半成 品稀释成每1ml含58，500 IU/1.8mg；

3）纯度测定  每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg；

①核酸含量测定

取本品2～3ml,采用紫外-可见分光光度法，于波长260nm处测定吸光度 ，按

计算核酸含量，测定结果为0.002mg/mg蛋白质；

②多糖含量测定

以生理氯化钠稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100ug/ml，葡萄糖标准 溶液，将硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g， 加入到10ml乙醇中，将上述溶液混合，配置成蒽酮混合液；分别精确 量取1.0ml,不同浓度标准葡萄糖溶液，以及本品，加入4.0ml蒽酮混合 液，混均，置沸水浴20分钟后与波长620nm处测定吸光度，计算多糖含 量为0.072mg/1mg/mg蛋白质；

（5）候选物选择 选择蛋白质含量适宜，核酸和多糖总量未超出标准 的候选物冻干，每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg，核酸 和多糖含量共计0.072mg/1mg蛋白质；

（6）定量分装、冷冻真空干燥，用误差≤1%的分装仪器定量分装，按 适宜冻干曲线冷冻干燥，1200ml结核菌素分装1163支安瓿，每支分装 量1ml，剩余30ml；

附录  培养基及试剂的配制

（1）小川培养基

１）成分 

２）制法

将鲜鸡蛋用肥皂洗刷，用自来水冲洗干净,将洗净鸡蛋浸入75%酒精中 数分钟，用无菌纱布将鸡蛋表面酒精擦干，用无菌镊子除去鸡蛋一端 外壳，将此端朝下，并在上端打一小孔，使蛋液流入带有玻璃珠的大 口瓶中，摇晃使蛋清蛋黄混合均匀，将盐溶液及2%孔雀石绿6ml倾入蛋 液中摇匀，通过两层纱布灭菌漏斗过滤分装试管，将试管在血清凝固 器中摆成斜面，85-90℃灭菌1小时，第二天可重复一次，取出经无检 合格即放2-8℃冰箱保存备用；

（2）苏通合成培养基

１）成分  

２）制法

将配方中的固体成分加入少量预冷注射用水中；徐徐加热，使全部材 料溶解；入余水和甘油，用氢氧化钠溶液调整pH至7.0；加热煮沸，滤 过后分装，以116℃灭菌40分钟或121℃灭菌30分钟；

（3）40%和1%的三氯醋酸溶液

40%三氯醋酸溶液：将400g三氯醋酸溶于1000ml预冷注射用水中即可，

1%三氯醋酸溶液：将1份40%三氯醋酸溶液和9份预冷注射用水混合均匀 即可；

（4）1mol/L氢氧化钠溶液

将分析纯40g氢氧化钠加预冷注射用水至1000ml即可；

（5）1mol/L盐酸溶液

将质量百分浓度：36%-38%；摩尔浓度：12mol/L 的83.3ml浓盐酸和 917.7ml预冷注射用水混合均匀即可；

（6）pH7.4磷酸盐缓冲液

甲液：1/30 mol/L 十二水磷酸氢二钠  取11.9g十二水磷酸氢二 钠溶于1000ml预冷注射用水中即可；

乙液：1/30 mol/L 磷酸二氢钾  取4.5g磷酸二氢钾溶于1000ml预 冷注射用水中即可；

将81份甲液和19份乙液混合均匀，调pH至7.4，121℃灭菌30分钟。