[发明专利]牛型结核菌素标准物质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛型结核菌素标准物质及其制备方法，属于标准物质技术和兽用生物制品 技术领域。

背景技术

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的对动物和人的一种慢性细菌性疾病，该病呈世界性分 布，也是我国牛的主要传染病，能够传播给人类，使人患结核病，对人类的健康威胁较大。 由于我国对牛结核病阳性牛实行淘汰制度，牛结核诊断技术尤为重要，牛结核菌素诊断技 术是世界动物卫生组织(OIE)推荐的唯一诊断方法。提纯牛型结核菌素产品的效价标定， 是用豚鼠的皮肤变态反应方法，用标准品作为对照，通过皮肤反应面积的比对，用统计学 方法确定牛结核菌素产品的国际单位(IU)含量。由世界动物卫生组织(OIE)指定的参 考实验室提供国际标准品，也称之为基准标准品，各国实验室用国际标准品溯源制备各自 国家的国家标准品，用于结核菌素产品的标定。然而，标准品的质量要求高，制备方法和 检验或标定方法严格，有关制备程序和标定方法至今未见有关报道。

发明内容：

本发明的目的是建立一种利用由我国分离的牛分支杆菌来制备牛型结核菌素标准物 质的方法以制备出合格的牛型结核菌素标准物质。

本发明是通过一下技术路线来实现的，即是通过利用由我国分离的牛分支杆菌经过培 养、灭活、过滤、纯化及冻干工艺过程制备牛型结核菌素，并通过对其中的蛋白、核酸及 多糖含量的测定及结合豚鼠和牛的皮肤敏感试验测定而制备出牛型结核菌素标准物质。

本发明的详细描述：

一、牛型结核菌素标准物质的制备

1.培养基

苏通合成培养基(农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规 程，2000年版，化学工业出版社，2000)成分包括如下，天门冬素、柠檬酸、硫酸镁、磷酸 氢二钾、柠檬酸铁铵、甘油等，每种成分均为分析纯。

2.菌种

本发明所用的牛分枝杆菌C68001和C68002株由中国兽医药品监察所提供。

(1)菌种特性

1)菌种形态在光学显微镜下观察，菌体为细长、直或稍弯的杆菌，长约1.5～4微米， 宽0.2～0.6微米，革兰氏阳性，抗酸染色阳性。

2)培养特性在配氏(Petragnani)固体培养基培养20天以上，生长的单个菌落为淡 黄色颗粒状，较为干燥。在苏通培养基中生长良好，培养20天培养基表层应出现较丰富 的菌膜，液体应清亮，生长纯粹，培养时间视生长情况一般2～3个月。

3)毒力对家兔耳静脉注射活菌6～10mg，可致死家兔。

(2)生产用种子制备

1)一级种子制备将冻干菌种开封后，接种小川培养基(见附录1)置37℃温室中 培养约两周左右，发育生长呈黄色颗粒状菌落或菌苔，为一级种子。

2)二级种子制备用铂金铲钩取一级种子菌苔或菌落，均匀涂布于数支小川培养基 斜面上，置37℃温室中培养10天左右，用铂金铲从小川培养基斜面上钩取菌苔，在苏通合 成培养基(见附录2)试管内壁充分研细，然后倾斜试管，用培养基轻轻接触菌体，使其 浮在培养基液面上，缓慢移至37℃温室中培养7～15日，则在培养基表面形成薄的菌膜。 用铂金环挑出一块菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37℃温室中培养7～15日，即可在 培养瓶液体表面形成具有弹性的菌膜，再菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37℃温室中 培养7～15日，在球瓶液体表面上形成微有皱褶、弹性较强的菌膜，此菌膜即可作为大量 生产的种子，经肉眼观察，液体必须清亮，菌膜纯粹、薄白、无杂菌污染作为二级种子。

3.牛型结核菌素的制备

(1)接种挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，轻轻放回原处。

接种完毕后，应对已接种的培养基瓶逐瓶进行检查，发现有种子下沉或散开者应进行 再接种。接种结束后，小心移入温室中，轻放于培养架上。

(2)培养于室温下培养2～3个月菌膜应生长较厚，应停止培养。

(3)灭活培养结束，培养物经121℃30min灭活处理。

(4)混合粗滤首先各取两个菌株对应批号、相同瓶数的培养物混合后用双层纱布加一 层铜纱滤过除去菌膜。