[发明专利]一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体，包括筛选标记及终止子，其特征在于启动子为突变后的tac启动子tac-M，及位于其后人工合成的多克隆位点L-MCS。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述tac-M启动子，其核苷酸序列为：tgagctgttg acaattaatc atcggtgtg gaattgtgag cggataacaa tt，其中加框部分为延长的-10区。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述多克隆位点L-MCS为74bp，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，BglII，SacII，AflII，PstI和HindIII，其核苷酸序列为gaattcgcta gcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatctccgcggctta agctgcagaa gctt。

5.权利要求1，2，3，4任一所述的表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步：使用2种不同限制性内切酶切割多克隆位点L-MCS片段，并连接到同样双酶切的pDXW-6(Xu et al.，2009)上，取代pDXW-6原有的多克隆位点，由此产生的质粒为pDXW-9；

第二步：通过重叠PCR技术，对pDXW-9上的tac启动子进行定点突变得到启动子tac-M；

第三步：使用2种不同限制性内切酶切割获得含tac-M启动子的片段；将质粒pDXW-9用同样的限制性内切酶双切，纯化回收大片段，将含有tac-M启动子的片段与回收的大片段连接，构建出新的质粒命名为pDXW-10。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于第一步中的2种限制性内切酶为EcoRI和HindIII。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于第三步中的2种限制性内切酶为ScaI和SalI。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述重叠PCR使用下述引物对：

tac-F：ggtgagtact caaccaagtc attctg

tac-mid-R：aattaatcat cgtgtggtac catgtgtgga attgtgagcg g

tac-mid-F：atggtaccac acgatgatta attgtcaaca gctcatttca gaatat

tac-R：ggcatcggtc gacgctctcc cttatg