[发明专利]一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等，1991)。

由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识(Eggeling andBott，2005；Burkovski，2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。

可应用于棒状杆菌的载体系统的构建，是生产菌株的代谢工程改良以及棒状杆菌基础研究的基础。目前，已经有一些可以应用于棒状杆菌的表达载体(Eggeling and Bott，2005)。根据不同的棒状杆菌复制子，我们把这些表达载体分为四组。第一组包括pEKEx1和pXMJ19，其复制子来自质粒pBL1；第二组包括pVWEx1和pZ8-1，其复制子来自质粒pHM1519；第三组包括pECTAC-K99，pECTAC-XK99E，pECTAC-XC99E和pECTAC-XT99A，其复制子来自质粒pHM1519；第四组包括pAPE12，其复制子来自质粒pNG2。所有这些载体都有两个缺点：一是在多克隆位点处含有较少的单限制酶酶切位点，另一是基因在lacI^q的控制下进行诱导表达，且表达量低。

应用代谢工程进行菌种改良时，我们将经常要共表达来自同一个生物合成或降解途径的多个基因。携带许多限制性内切酶的多基因大片段DNA可能不能被克隆到含较少单限制酶酶切位点的多克隆位点处(Radmacher等，2002)。此外，在棒状杆菌中，tac启动子的转录活性较低(Liebl等，1992；Billman-Jacobe等，1995；Salim等，1997；Xu等，2009)，致使插入到载体上的外源基因表达量较低，这限制了工程菌中目标代谢产物的生产。另外，已存在的棒状杆菌中的表达载体大都为诱导型表达载体，在生产过程中需要添加诱导剂IPTG，而IPTG相当昂贵，不适于用做大规模生产目的产品的基因表达诱导剂；乳糖能够用来替代IPTG作为诱导物应用于大规模的生产，而对于绝大多数的棒状杆菌菌株而言，乳糖都不能进入其细胞中(Brabetz等，1991)，这也限制了诱导型表达系统在棒状杆菌中的应用。在本发明中，我们构建了新型棒状杆菌表达载体，新的载体具有中等强度的启动子tac-M，改善了多克隆位点的切点数目，插入的基因进行组成型表达。作为一个应用例子，我们在黄色短杆菌中成功地应用表达了编码氯霉素酰基转移酶(CAT)的cat基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体。

本发明提供的表达载体包括筛选标记及终止子，其特征在于启动子为来源于棒状杆菌的改造后tac启动子tac-M及位于其后人工合成的多克隆位点L-MCS，命名为pDXW-10。

本发明提供的表达载体，其特征在于其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

表达载体pDXW-10含有一个在棒状杆菌中具有较强转录启动功能的tac-M启动子，从79位到18位。

表达载体pDXW-10含有在大肠杆菌和棒状杆菌中具有转录终止功能的终止子rrnBT1T2，分别从8075到8032位，及从7900到7873位。

表达载体pDXW-10含有用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，从413位到1228位；

表达载体pDXW-10含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的rep片段，从1635位到4320位。

表达载体pDXW-10含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点L-MCS，从8349位到8275位，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，BglII，SacII，AflII，PstI和HindIII，其核苷酸序列为gaattcgcta gcgagctccc atgggcggccgcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt。