[发明专利]一株羰基还原酶重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法

说明书

技术领域

从近平滑假丝酵母基因组中钓取新型羰基还原酶基因scr II，通过基因工程手段构建重组菌株，用于高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。 

背景技术

光学纯的苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极具意义。 

苯基乙二醇的化学结构为： 

手性化合物的制备方法包括化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法和生物法。其中生物法具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，能完成化学合成法难以进行的反应。 

在生物制备(S)-苯基乙二醇的反应中，仅少数真菌或酶能催化底物2-羰基苯乙酮，产生不同空间构型的苯基乙二醇。Bakers’yeast和Geotrichum sp.能将低浓度的2-羰基苯乙酮分别还原为(R)-和(S)-苯基乙二醇。来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011的(R)-和(S)-羰基还原酶能催化2-羟基苯乙酮产生苯基乙二醇的不同对映体。但多数已报道的不对称还原反应中，酶催化的底物浓度和终产物的光学纯度都较低。通过构建基因工程菌来增加目标蛋白的表达量以促进转化反应，但是效果不显著。吕腾飞等采用过量表达(S)-羰基还原酶SCR的重组菌制备(S)-苯基乙二醇，底物2-羰基苯乙酮的浓度只有3g/L，产物的光学纯度也仅为91％。 

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011可催化制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，利用全基因组分析方法从中钓取一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II，构建了目标基因的重组菌，实现了高底物浓度下高效低成本不对称转化制备(S)-苯基乙二醇。 

发明内容

本发明的目的在于根据近平滑假丝酵母基因组序列分析方法，克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II，利用构建的重组菌CCTCC NO：M 209289催化 2-羟基苯乙酮，高效制备具有光学活性的(S)-苯基乙二醇的方法，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为100％e.e.和98.1％。 

本发明的技术方案：一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCR II，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 209290。 

所述重组菌株CCTCC NO：M 209290的构建方法，将羰基还原酶基因scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pETSCR II，即CCTCC NO：M 209290；步骤为： 

①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取 

用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC NO：M 203011； 

羰基还原酶基因scr II的克隆：以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011基因组为模板，以含有BamHI酶切位点的 

SCR II_F：5’-ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3’，和含有XhoI酶切位点的 

SCR II_R：5’-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3’为引物，PCR扩增反应获得scr II基因，基因全长840bp；基因scr II的GenBank编号为：GQ411433； 

PCR体系为：ddH₂O 35.5μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L Mg²⁺3μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，25pmol/μL的引物SCRII_F和SCR II_R各1μL； 

PCR反应条件：94℃4min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min； 

②重组质粒pETSCR II的构建：