[发明专利]猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗

说明书

1.技术领域  本发明涉及一种猪副嗜血杆菌三价油乳剂灭活的制备方法及其在预防由猪副嗜血杆菌引起的各种病症中的应用。

2.背景技术  猪副嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪Glasser’s病的病原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可以在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。猪副嗜血杆菌是一种非溶血性，非运动性、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。

在猪群的养殖中，做好平时的预防工作尤为重要。猪副嗜血杆菌是一种内继发性疾病，存在多种传播方式，导致猪副嗜血杆菌定居于仔猪体内的时间不同，定居时间取决与母猪免疫情况、母猪带菌水平、仔猪母源抗体水平等。有研究表明，对母猪接种猪副嗜血杆菌细菌灭活苗，母猪免疫后产下的仔猪要比未免疫过母猪生下的仔猪出现肺炎和关节炎的几率要小，而且相对症状较轻，增重也要高于后者，从而说明了母源抗体对仔猪有良好的保护作用。但是，随着日龄的增大，断奶仔猪母源抗体逐渐衰减以至不能有效预防带菌仔猪感染无猪副嗜血杆菌感染定居的仔猪，所以设法减少带菌仔猪的比例是控制猪副嗜血杆菌对生产造成影响的有效方法，对仔猪通过有效疫苗的免疫就显得至关重要。Solano(1998)通过对仔猪进行疫苗接种表明可以使仔猪的免疫保护时间更长。大量研究证实了免疫商品疫苗成功的案例，目前使用的疫苗主要是灭活的单价及二价灭活疫苗，通过接种这些疫苗可以有效控制该疫病的发生。但是，由于猪副嗜血杆菌本身血清型较多，商品疫苗是否具有较好的交叉保护就成为很现实的问题，所以，研制一种多价血清型且含有独特菌株的商品疫苗是非常关键的。

3.发明内容  现有的猪副嗜血杆菌灭活苗多为单价及二价灭活苗，分别针对血清4型、血清5型及血清13型。本发明提供一种三价的灭活疫苗，同时预防当前我国猪副嗜血杆菌流行菌株的主要血清型即血清4型、5型和13型引起的疾病。

4.技术方案  本发明的技术方案是，将猪副嗜血杆菌血清4、5、13型分离株分别进行培养，灭活后加入吐温-80制成油乳剂的水相；利用马可52轻质石蜡油及司本-80、硬脂酸铝制成油相。将水相和油相等体积混合后乳化，从而得到猪副嗜血杆菌三价灭活疫苗。其具体制备方法如下：

1)细菌的培养：将猪副嗜血杆菌血清4型、5型和13型三株种子菌分别接种于TSA固体培养基，37℃恒温箱中培养，24h后挑取单个菌落，接入含NAD及小牛血清的TSB液体培养基中，37℃、180r/min条件下振荡培养12-16h后再将此菌液按1％的比例加入新配制的TSB液体培养基中进行大量增殖。37℃、180r/min振荡培养24h后，收集菌液，用分光光度计测定细菌总菌含量。

2)细菌的灭活：按TSB液体培养基总体积加入0.3％甲醛灭活，于37℃振荡灭活11-13h。

3)油乳剂水相的制备：三个血清型的菌种灭活后，将各个血清型的菌液浓度均调至1×10¹⁰CFU/ml，按1∶1∶1的体积比混合，按总体积4％加入灭菌吐温-80，边加边搅拌。

4)油相制备：取马可52轻质石蜡油93份，加入硬脂酸铝1份并搅拌直到透明为止，随后加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温备用。

5)油乳剂灭活苗的制备：将制备好的油相和水相等体积混合，边加边搅拌，至完全溶解，并于均质机中进行乳化。

本三价油乳剂灭活苗的保存条件为：2～8℃。

本发明的优点是可以预防由猪副嗜血杆菌血清4、5、13型菌株引起的疾病，对于同血清型菌株的免疫保护达到85％。相对于目前的商品疫苗来讲，可以单针免疫较多的血清型，使用方便，并提高了对其他血清型交叉保护的可能性。

具体实施方式

结合实施对本发明做进一步描述和论证。

实施例1

已制备好的猪副嗜血杆菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗，昆明种小鼠70只，灭菌生理盐水，规格为1ml注射器，疫苗菌株。

实验步骤：

1、70只小鼠分为注射疫苗组30只，攻毒组30只，空白对照组10只。

2、疫苗组小鼠每只颈部皮下注射疫苗0.2ml，空白对照组注射等量灭菌生理盐水。

3、全部小鼠均置于相同条件下饲养，14d后，进行攻毒保护试验。