[发明专利]含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物

说明书

发明背景

极少生物反应化合物以溶解形式在任何长的时间内保持稳定，尤 其在室温下储存更是如此。因此，过去进行了大量评价增强干燥形式 生物反应化合物储存能力可能性的研究。

基于在干反应化合物领域的大量现有技术文献，本领域技术人员 确信为了确保例如聚合酶在重新溶解时的生物活性，使用至少一种稳 定添加剂是必不可少的。

WO 2008/36544描述了为提供干组合物的所谓填充材料的应用， 所述填充材料是例如：糖类(如FICOLL^TM、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、 松三糖、DEXTRAN^TM或甘露醇)、蛋白质(如BSA、明胶或胶原)以及 聚合物(如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。在US 5,098,893、US 5,200,399和US 5,240,843中进一步描述了用于稳定生物试剂的玻璃形 成的填充材料。在US 3,300,474中公开的填充材料FICOLL^TM是共聚 物。

此外，液体反应混合物的干燥方法在大多数情况下本质上是非常 复杂的，因此干燥程序有很高的要求而且昂贵。在文献中，冻干(US 5,593,824)或真空干燥(US 5,565,318)用于干燥糖类聚合物基质中的生 物材料。冷冻干燥法即冻干是在很多现有技术文献中公开的充分建立 的蛋白质储藏技术(例如Passot，S.，等，Pharmaceutical Development and Technology 12(2007)543-553；Carpenter，J.F.，等，Pharmaceutical Research 14(8)(1997)969-975；Schwegman，J.J.，等，Pharmaceutical Development and Technology 10(2005)151-173)。

在US 7,407,747中描述了包含Taq聚合酶遗传修饰的用于测序的 不同反应混合物干燥条件的选择。所使用的干燥程序是冻干、在没有 另外加热下的离心真空蒸发浓缩(speedvac)、在另外加热下的离心真空 蒸发浓缩和室温风干。对该专利内的反应混合物进行了有关各种冷冻 保护剂如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMANO)的试验。 此外，还进行了在没有任何冷冻保护剂下的实验，但没有公开关于那 些反应混合物稳定性随时间变化的数据。仅报道了含有海藻糖和牛血 清白蛋白(BSA)的反应混合物长达8周的良好稳定性。

此外，US 7,407,747公开了使用各种测序混合物中的聚合酶的实 验，所述测序混合物包含缓冲液、核苷酸、含荧光标记的核苷酸和引 物的各种组成。尚没有公开是否可干燥并储存用于实时PCR扩增的混 合物(即含有缓冲液、核酸、引物和检测探针的混合物)中的聚合酶而 不影响聚合酶的PCR活性。

本发明提供了干燥实时PCR混合物内Taq DNA聚合酶的方法， 而所获得的干组合物可被储存但不影响Taq DNA聚合酶的PCR性能。

发明概述

提供含有聚合酶的反应化合物的干组合物是一个复杂的问题，特 别是在以下情况：意欲将所述干组合物储存一定时间并且所述干组合 物随后的重新溶解必须尽可能不影响PCR应用的聚合酶活性。

在干燥含不同组分的液体溶液过程中，所述组分的浓度会不断增 加，致使其性质彻底改变，而液体溶液的确切性能取决于各组分和干 燥程序。技术人员认识到的是，例如高盐浓度将使蛋白质失去稳定性， 缓冲液在高浓度下性能将改变，导致产生极端的pH值。

如上文所述，本领域技术人员了解可加入到含有聚合酶的溶液中 以增强聚合酶在干燥过程中的稳定性的某些化合物。此外，如果某种 聚合酶的混合物的组分会改变，那么本领域技术人员将不能预料可得 到该聚合酶的相同干燥效果。

例如，US 7,407,747公开了可在由以下物质组成的混合物中干燥 Taq聚合酶：缓冲液、核苷酸、BSA和海藻糖，并且公开了所述聚合 物可保持活性长达8周。

开发了本发明的方法以提供PCR应用的聚合酶干组合物，所述组 合物不仅包含缓冲剂和核苷酸，而且还包含另外的组分(即引物乃至引 物和探针)，以构成完整的检测混合物。