[发明专利]MBD重组蛋白及其表达方法

权利要求书

1.MBD重组蛋白，其特征在于重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其序列如下：

  1MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV

 61PMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF

121EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA TWKEKDGAVE AEDRVTIDFT

181GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE EFTIDVTFPE EYHAENLKGK

241AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE VRKNMERELK SAIRNRVKSQ

301AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA LELPRELFEE QAKRRVVVGL

361LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS KNKELMDNMR NVALEEQAVE

421AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP RGSGGIEGRH MDDDDKASAS

481PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGWTRKLKQ RKSGRSAGKY DVYLINPQGK AFRSKVELIA

541YFEKVGDTSL DPNDFDFTVT GRGS。

2.MBD重组蛋白表达方法，其特征在于对人Mecp2的MBD区行密码子优化，并人工合成编码MBD的DNA，克隆至原核表达载体pCOLD-TF，转化大肠肝菌Rosetta-DE3，以IPTG在15℃诱导表达，镍柱亲和纯化，获得具有特异性结合甲基化DNA功能的MBD蛋白；具体步骤如下：

(1)对人Mecp2的MBD区的编码DNA序列进行优化，并人工合成核酸片段；

(2)通过双酶切，将目的核酸亚克隆至原核表达载体pCOLD-TF上，构建重组表达质粒pCOLD-TF-MBD；

(3)重组表达质粒pCOLD-TF-MBD热激法转化感受态细胞Rosetta-DE3；

(4)加入IPTG，15℃诱导表达20h；

(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；

重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其序列如下：

  1MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV

 61PMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF

121EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA TWKEKDGAVE AEDRVTIDFT

181GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE EFTIDVTFPE EYHAENLKGK

241AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE VRKNMERELK SAIRNRVKSQ

301AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA LELPRELFEE QAKRRVVVGL

361LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS KNKELMDNMR NVALEEQAVE

421AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP RGSGGIEGRH MDDDDKASAS

481PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGWTRKLKQ RKSGRSAGKY DVYLINPQGK AFRSKVELIA

541YFEKVGDTSL DPNDFDFTVT GRGS。

3.根据权利要求2所述的MBD重组蛋白表达方法，其特征在于步骤(1)是根据大肠杆菌密码子偏爱性对MBD编码序列进行优化，优化后并被用于表达的人工合成核酸序列为：5′-GCTAGCGCGA GCCCGAAACA GCGGCGTAGC ATTATTCGCG ATCGCGGCCC GATGTATGATGATCCGACCC TGCCTGAAGG CTGGACCCGT AAACTGAAAC AGCGTAAAAG CGGCCGTAGCGCGGGCAAAT ATGATGTGTA TTTGATTAAC CCGCAGGGTA AAGCGTTTCG TAGCAAAGTGGAACTGATTG CGTATTTTGA AAAAGTGGGC GACACCAGCC TGGATCCGAA CGATTTTGATTTTACCGTGA CCGGTCGTGG GAGC-3′。