[发明专利]MBD重组蛋白及其表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲基化的CpG结合域(methyl-CpG-binding domain，MBD)蛋白重组表达方法，属分子生物学和生物技术领域，特别涉及MBD重组蛋白及其表达方法。

背景技术

DNA异常甲基化与基因表达沉默密切相关。人类的DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸上，形成甲基化的CpG二核苷酸(^mCpG)。甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)是一类能特异识别^mCpG，并与之结合的核蛋白。典型的MeCPs含有保守的甲基化DNA结合基序MBD，是与^mCpG结合的关键区域。MeCP2是MeCPs家族中第一个被发现的能特异结合甲基化DNA的蛋白质。其N-末端含有一个约70个氨基酸的区域，能够选择性的结合甲基化的DNA，即MBD。MBD能与甲基化的DNA特异结合，此特性可被应用于MBD亲和柱，甲基化芯片等甲基化研究工具。

在本发明之前，获得具生物学活性的MBD的高效重组表达一直是一个难题。不同的表达方案都不可避免的存在着不足之处：酵母和哺乳动物细胞等真核表达系统，操作繁琐，且重组蛋白产量很低；以往普通的原核表达，尽管产量通常高于真核表达系统，但由于大肠杆菌密码子的偏爱性，高效表达依然困难。此外，传统方法重组表达的MBD蛋白难以保留天然MBD蛋白特异性结合甲基化DNA的生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种MBD的重组蛋白及其表达方法。

本发明的技术方案是：

MBD重组蛋白，其主要技术特征在于重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其序列如下：

1   MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV

61  PMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF

121 EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA TWKEKDGAVE AEDRVTIDFT

181 GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE EFTIDVTFPE EYHAENLKGK

241 AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE VRKNMERELK SAIRNRVKSQ

301 AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA LELPRELFEE QAKRRVVVGL

361 LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS KNKELMDNMR NVALEEQAVE

421 AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP RGSGGIEGRH MDDDDKASAS

481 PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGWTRKLKQ RKSGRSAGKY DVYLINPQGK AFRSKVELIA

541 YFEKVGDTSL DPNDFDFTVT GRGS。

本发明的另一技术方案是：

MBD重组蛋白表达方法，其主要技术特征在于对人Mecp2的MBD区行密码子优化，并人工合成编码MBD的DNA，克隆至原核表达载体pCOLD-TF，转化大肠肝菌Rosetta-DE3，以IPTG在15℃诱导表达，镍柱亲和纯化；具体步骤如下：

(1)对人Mecp2的MBD区的编码DNA序列进行优化，并人工合成核酸片段；

(2)通过双酶切，将目的核酸亚克隆至原核表达载体pCOLD-TF上，构建重组表达质粒pCOLD-TF-MBD；

(3)重组表达质粒pCOLD-TF-MBD热激法转化感受态细胞Rosetta-DE3；

(4)加入IPTG，15℃诱导表达20h；

(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；

重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其序列如下：

1   MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV