[发明专利]一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法及试剂盒。 

背景技术

胶原蛋白是人体和动物的结缔组织的主要蛋白，是哺乳动物含量最多，分布最广的蛋白质，含量能够占总蛋白的25％～35％，体内具有广泛的生物学活性。在肌肉组织中它是肌内膜的主要成份，I型胶原蛋白是人体中含量最多的胶原蛋白，瘢痕组织中含量丰富，它也是组织愈合和修复的产物。肌腱、皮肤、动脉血管壁、软骨以及部分的器官和牙齿中也含有I型胶原蛋白。I型胶原蛋白合成紊乱会导致骨折、轻微脊柱弯曲、关节松弛、皮肤弹性过度综合征(cutis hyperelastica)、婴儿骨外层肥厚(infantile cortical hyperostosis)等疾病。 

目前，基因表达水平检测主要是通过聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)来完成，PCR是一项广泛应用于分子生物学的实验技术，通过热稳定的Taq DNA polymerase，能够使模板中的单个或几个拷贝的基因片断在经过几十个热循环后进行指数扩增，达到数以百万计的拷贝。PCR产物经过电泳检测目的基因的表达量。这种方法是目前比较常用的基因表达相对定量检测方法，这种方法属于终点检测方法，由于不能够实时的监测反应的进行，所以实验的重复性、可靠性相对较差。 

随着分子生物学技术的不断发展，以及光电子技术的进步，近些 年来实时荧光定量PCR(Realtime PCR)技术得到了很大的发展。此技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。应用实时荧光定量PCR技术来检测基因的表达水平比以往的技术有了很大的进步，实时荧光定量PCR技术能够全程实时检测PCR反应的进行，因此具有良好的实验可靠性，重复性。实时荧光定量PCR有分为荧光染料掺入法和探针法。荧光染料掺入法是在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光信号，因此必须在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析产物的特异性。 

Taqman探针法：Taqman探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。随着引物的退火，产物的不断扩增，报告荧光基团能够被DNA聚合酶从探针上剪切下来，探针被打碎，这样报告荧光基团不再被淬灭，从而不断发射出荧光信号。因此应用Taqman探针法能够快速准确的检测组织和细胞中基因的表达变化。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的检测兔I型胶原蛋白基因的方法。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种检测兔I型胶原蛋白基因的方法，包括如下步骤： 

(i)用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物扩增生物样品； 

(ii)用探针对扩增产物进行检测，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。 

优选地，步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测同时进行。 

更优选地，采用实时荧光定量PCR法进行步骤(i)所述扩增与步骤(ii)所述检测。所述实时荧光定量PCR法反应程序优选为：95℃ 10min；95℃ 30sec；58℃ 1min；72℃ 1min为一个循环，设定45个循环。 

更优选地，步骤(ii)所述探针为TaqMan探针。所述TaqMan探针其5’端标记6-FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、CY5、CY3、JOE、Texas Red其中一种，3’端标记TAMRA、BHQ-1、Eclipse、IowaBlack其中一种。 

本发明还提供一种检测兔I型胶原蛋白基因的试剂盒，包含用于扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核酸片段的引物。 

优选地，本发明所述试剂盒中的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸片段、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸片段中的至少一种。 

更优选的，本发明所述试剂盒还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。