[发明专利]从马比木中提取喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然药用植物马比木的深加工领域，尤其涉及一种利用微生物发酵与溶剂提取结合技术从马比木中提取高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法。

技术背景

传统的喜树碱(Camptothecin)生产是从中国特有的珙桐科植物喜树中提取出来的。然而喜树碱在喜树中含量低，根皮中含量为万分之四，果实中含量为万分之七，枝叶中含量极少，9-甲氧基喜树碱在喜树中含量更少，天然提取时其生产成本高、产量低，且植物资源有限。因此，寻找替代资源以及对其综合利用，是解决喜树碱资源瓶颈的关键。

马比木，学名：Nothapadytes foetida(Wight)Sleum茶茱萸科Icacinaceae，小灌木。原产地：台湾兰屿。在印度有少量分布。现经调查发现，该物种在武陵山区有大面积生长。

在此之前，国外有文献(phytochemry，1972，11)介绍印度产一种铁青树科(即丁皮木科OLacaceae)马比木属植物Mappa foetida Mlers(译为臭花马比木)中含喜树碱，其含量比喜树要高，但在中国尚未发现此种植物。意大利因迪纳有限公司的发明人E·鲍姆巴德利和L·威罗塔发明专利“从马比木分离的喜树碱骨架化合物及其作为新药物及治疗剂的合成子的途径”〔申请号97194492.X〕说明了马比木分离的喜树碱骨架化合物，但未叙述喜树碱的提取工艺。中国发明专利〔申请号891012184〕，发明人张宪德公开了从假柴龙树中提取喜树碱的新方法。该方法是以假柴龙树植物为原料，将其粉碎后用常规方法提取或萃取，再反复精制得到喜树碱；母液经回收处理、分离还获得另一种抗肿瘤药物有效成分甲氧基喜树碱。但该发明采用的传统的方法，未说明提取得率，也无具体实施方案，而且所述工艺过程简单，无数据说服力，未获批准。

本发明以马比木为原料，利用微生物发酵技术进行高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱生产方法的研究。经研究发现，马比木植物中喜树碱的含量只有根皮含量较高，其根皮中喜树碱的含量是喜树果的2倍以上，枝茎叶中喜树碱的含量并不比喜树果高，而且随季节的变化其含量变化很大；研究还发现马比木植物中9-甲氧基喜树碱含量很是丰富，很有工业生产价值。同时还发现，马比木中的部分喜树碱是以苷类形式存在，传统的喜树碱提取工艺会造成此类物质的丢失，通过微生物发酵技术，可以使苷类转化成喜树碱，使喜树碱的平均含量达喜树果的3.6倍以上，从而提高喜树碱的得率，达到了节约植物资源，降低成本的目的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵技术从马比木中提取高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法。

本发明一种从马比木中提取喜树碱的方法，其步骤包括：

(1)预处理及发酵步骤：将马比木材料破碎，按原料酶液比为1∶1~2(w/w)投入发酵罐或发酵池，在温度为20～50℃，发酵1～5天，所述的酶为安琪高糖干酵母或发利干酵母，其在水溶液中的量为1~10‰(w/w)；

(2)溶剂提取步骤：将上述步骤(1)中得到的发酵混合物投入提取罐，使用冷渗法、温浸法或回流法中的一种方法提取1-12小时，每次溶剂的加入量为初始原料的6~10倍(w/v)，溶剂提取1～3次，过滤，合并提取液；所述的溶剂为下述溶剂中的一种：A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt％；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占0-100wt％；

(3)浓缩步骤：将步骤(2)中得到的提取液加入抗氧化剂，浓缩，得浓缩浸膏，所述的抗氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种或两种，用量为提取液的0.5～10‰(w/v)；

(4)萃取步骤：将提取物浓缩液用酸调pH值至1～6，然后加入1~3倍量有机溶剂(v/v)，萃取，静置，收集有机相，萃余项重复萃取2～3次，合并有机相，浓缩，回收溶剂，得粗提物浸膏，所述的酸为醋酸、甲酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；

(5)分离步骤：

(a)将粗提物浸膏中加入10-100％丙酮水溶液，搅拌均匀，静置12～24小时，抽滤，滤饼为含喜树碱的粗品；

(b)将上述(a)中喜树碱的粗品加入脂肪醇或脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中一种混合物，混合物中脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种溶剂比例为(5-95％，v/v)，搅拌，静置，抽滤，滤饼为含喜树碱的粗品；

(c)将上述(b)得到的滤饼使用不同pH的水溶液溶解，过滤，结晶，使用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷、二甲基甲酰胺中混合溶剂进行重结晶；