[发明专利]富硒红球藻粉的制备方法及应用

权利要求书

1.一种富硒红球藻粉的制备方法，其步骤是：

A、筛选硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系：藻种在红球藻培养基中生长，利用理化诱变和分子生物学育种技术，筛选出对无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系；

(1)紫外线诱变为物理诱变剂之一，根据波长将紫外线分为UVA、UVB、UVC三种，其波长分别为320-400nm、280-320nm、100-280nm，对诱变有效的范围是200-300nm，紫外线的作用是使DNA双链之间或同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的配对，引起突变；

经紫外诱变处理后的藻株要暗处理后再进光照培养，将20W的紫外灯打开，预热20分钟，紫外灯发出的波长处于稳定后，分别取处于对数生长期藻液6mL，置于小培养皿内，在磁力搅拌下，在距离紫外灯30cm处进行照射，时间分别为3、4、5分钟，各重复3次；取5mL紫外照射处理后的藻液接种到装有20mL培养液的50mL小锥形瓶中，遮光3小时以避免光修复，再重新放回到光照培养箱中培养3天，血球计数法对藻细胞进行计数，选择致死率在50％-80％的处理，进行双层平板分离，挑取生长快、体积的克隆，接种于25mL小锥形瓶中培养，将正常生长状态的克隆分别接种至250mL锥形瓶中继续培养，每10天继代培养一次，共4次，突变株表现特性稳定的克隆，并进行硒难受性、硒蛋白和虾青素含量等特性检测，筛选得到稳定的突变株系；

(2)化学诱变方法：采用与诱变对象的化学诱变剂，化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、移码突变剂、脱氨剂、羟化剂，烷化剂有一个或活性烷基，它们易于取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或碱基起烷化反应，改变DNA的分子结构，引起突变，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍，一次处理使细胞发生一次或突变，使基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发临近位置的基因陆续连锁突变；

取对数期藻液4mL，4000rpm，25℃，离心5min，弃上清液，加入pH值6.5的无菌磷酸钾缓冲液5mL，洗涤三次，定容，加入NTG溶液，使终浓度分别为1.0g/L和2.0g/L，各3次重复，于25℃水浴中处理30分钟，加入等量的硫代硫酸钠终止反应；

处理过的藻液用无菌去离子水洗涤三次，去掉NTG溶液，最后接种到BBM培养基中，遮光处理12小时，再于光照培养箱中培养，稀释后的藻液采用与紫外线诱变相同的方法进行双层平板分离单克隆，进行硒难受性、硒蛋白和虾青素含量等生物学特性检测，筛选得到稳定的突变株系；

B、将筛选得到的目标藻株在温度22-30℃、pH 6.5-7.0、光照1000-3000勒克斯，利用红球藻培养基进行培养2-15天；

C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，采用接种培养基中直接加硒或当藻细胞达到生物量后加入无机硒的方法，其培养基中无机硒的浓度是低浓度10-30mg/L或高浓度200-500mg/L；

D、藻细胞连续培养2-15天后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水或清洗液冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒，利用烘干、喷雾干燥或冷冻干燥方法获得富硒雨生红球藻藻粉。

2.权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备食品中的应用。

3.权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备保健品中的应用。

4.权利要求1所述的一种富硒雨生红球藻藻粉在制备药品中的应用。