[发明专利]一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于感染性疾病检测技术领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒，同时，本发明还涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，主要检测结核分枝杆菌、以及疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，适用于所有医院，包括传染病和结核病医院等用于对结核分枝杆菌的检测。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的、人兽共患的慢性消耗性传染病，给人类健康带来严重威胁。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，每年新发病人数800～1000万。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制的传染病之一。我国是结核病高负担国家，现有活动性肺结核病人500万人，传染性肺结核病人200万人，每年新增病例约130万人，因结核病死亡15万人之多(《全国结核病防治规划(2001-2010年)》，国办发[2001]75号文件)。国务院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。我国结核病疫情的严重程度仅次于印度，位居世界第二。我国结核病疫情呈三高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高，年递降率低。近年来由于HIV/AIDS流行、人口流动、耐药结核菌逐年增加，结核病发病率开始上升，结核病疫情更加严重。

运用新型检测方法对结核病进行早期检测与治疗具有十分重要的意义，目前国内外结核已有的检测技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的检测技术和产品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段。如传统的痰涂片法检测患者痰液中的结核杆菌，痰结核菌培养需耗时6-8周，检测时间过长。过去PPD(结核菌素纯蛋白衍化物)也常用于结核病的检测和流行病学调查，但是其特异性和敏感性均有一定局限性。又如传统的血清学抗体检测不能检测早期病菌抗原，不能检测窗口期病人和潜伏感染病人等缺陷。临床上对疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的检测方法，常常采用先抗结核治疗，再以治疗的效果为依据来进行检测，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他疾病的误诊或是延误治疗。所以，探索新型检测方法对结核病进行早期检测研究用于结核病快速、有效、方便、廉价的特异性检测，对于及时治疗结核病人和控制结核病传染疫情都具有十分重要的意义

发明内容

发明的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒是对结核分枝杆菌感染的早期检测，可直接检测结核分枝杆菌、或疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，比起传统通过痰培养的检测方法，从过去的2-4周缩减为半天左右时间。对结核分枝杆菌检测的具体过程和步骤是采用一种能特异性结合结核分枝杆菌H37Rv菌体抗原的单链DNA适配子作为探针，生物素标记该DNA适配子作为探针，类似间接ELISA法，用于检测结核分枝杆菌、痰液或体液中结核分枝杆菌或结核分枝杆菌抗原。

发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核病中结核分枝杆菌的方法，该方法将此单链适配子与结核病的检测结合起来，并把传统通过痰培养的检测方法从过去的2-4周缩减为半天左右时间。DNA单链适配子体外合成非常简单，而且价格低廉，同时本发明的方法操作简单，对于结核病中结核分枝杆菌的检测灵敏度和精确度均很高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种结核分枝杆菌的试剂盒，它包括酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子NK2，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技术有限公司)。

所述的的核酸适配子NK2为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特异性结合结核分枝杆菌的DNA单链适配子，命名为NK2(具体步骤见：发明专利申请号：200610019671.8，发明人：章晓联、陈凡)。

所述的生物素标记核酸适配子NK2的制备：将NK2序列送公司合成，公司合成生物素标记NK2的5’端(命名为：bio-NK2)。其序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20℃保存。

一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，它包括生物素标记核酸适配子NK2的制备。利用本发明试剂盒(即间接ELISA试剂盒)对结核分枝杆菌检测的具体过程和步骤如下：

1、将待检样品，如痰液或血液或体液，或细菌(1000CFU/mL)/痰液加在96孔酶标板，100μl/孔，4度孵育过夜。