[发明专利]一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子印迹技术领域，更具体涉及一种蛋白质分子印迹薄膜的制备 方法。适合于所有水溶性生物大分子的分子印迹。利用该方法制备的分子印迹膜 对目标蛋白具有一定的特异识别功能，可发展成替代抗体的检测蛋白质的分析产 品。

背景技术

分子印迹技术是一种合成人工抗体的技术，其主要原理是：首先选择能与模 板分子形成共价键或者非共价键的功能单体，与模板分子形成复合物，然后与交 联剂共聚形成交联聚合物。将模板分子洗脱后，在聚合物中留下与模板分子的形 状、大小和表面功能基团相匹配的孔穴，这些空穴能选择性识别模板分子。采用 分子印迹技术，制备对目标蛋白质分子具有优异识别能力的分子印迹膜，制成可 替代抗体的分子识别元件，是近年来生物芯片和生物传感器领域的一个新的研究 方向。

目前，常采用的蛋白质分子印迹膜的制备方法有以下几种：一、直接在传感 器表面(电极、QCM基片和SPR基片)上进行本体聚合形成蛋白质印迹膜。如 湖南大学姚守拙等Biosens.Bioelectron.2006，21：1244-1251通过溶胶-凝胶和化 学沉积的方法，在压电石英晶体-金电极表面制备的可识别人血清白蛋白的分子 印迹膜。其传感器的信号可随着被测蛋白浓度的增加而增加，不足之处是传感器 的选择性不够理想。二、采用与蛋白质抗原决定族组成相同的短肽，作为模板分 子，在平面上合成可识别蛋白质的分子印迹膜。如Tai等采用多肽印迹法制备了 检测登革热病毒的人工抗体膜Anal.Chem.，2005，77：5140-5143。但在Tai的工 作中测量重现性较差(CV在10％-32％)，原因是采用的模板分子是只有几个氨 基酸的短肽，不具备三维结构特征，而多肽的三维结构是抗原-抗体识别的主要 依据，所以该方法制备的印迹膜对蛋白质分子的识别效率难以把握。三、压印法， 将蛋白质模板固定在某一基片上形成“蛋白质印章”，与聚合物单体层紧密接触， 使聚合反应在很薄的液层中进行。该方法可以制得超薄分子印迹膜。如Chou等 [10-12]将蛋白质模板吸附在一块玻璃片上，与另一块涂布了功能单体和交联单体 的玻璃片紧密接触，通过紫外光引发，使聚合反应在两块玻璃片的夹层中进行， 制得蛋白分子印迹膜Biosens.Bioelectron.，2006，22：355-363，Biosens.Bioelectron.， 2006，22：534-543。Shi等将蛋白质吸附于亲水的、原子级平坦的云母表面，然后 将一个二糖分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上，通过大量的氢键与蛋白质络合，再 将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而沉积，得到 具有与蛋白质形状匹配的纳米空穴的分子印迹膜Nature，1999，398：593-597。然 而，Shi和Chou等以物理吸附的方法在固体表面上直接固定蛋白质分子，不仅 会引起蛋白质聚集，而且容易引起其构型上的变化，造成蛋白质变性，这样印迹 出来的孔穴对自然结构分子的识别能力会差，也造成了分子印迹膜的不均匀性。 四、自组装法，Britt等将蛋白质模板分子与三种磷脂共同自组装到固体表面上。 磷脂分子在固体表面上形成的单分子层，避免了蛋白质在固体表面的直接吸附， 其中带有正电荷的磷脂通过静电作用将带负电的蛋白质分子吸附在磷脂层上，而 连有PEG链的磷脂分子阻止了蛋白质分子间的聚集Biotechnol.Prog.2006， 22：150-155。上述方法虽然有利于单分子印迹孔穴的形成，也在一定程度上避免 了模板分子的变形。但是由于没有采用交联单体，对印迹孔穴的稳定性有一定影 响。

综上，前人在蛋白质分子印迹膜的制备方面虽然积累了不少宝贵的经验，然 而，蛋白质体积大，结构复杂(其表面形状不规则，功能基团多)，容易变形变 性，在有机溶剂中不稳定，给蛋白质印迹工作带来了很大困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，该方法简便、 经济，该方法采用蛋白质电泳常用的制胶原料丙烯酰胺作为功能单体，采用“三 明治”法即将模板蛋白、功能单体、交联单体和引发剂的混合溶液滴加在两块玻 璃片之间，使聚合反应在两块玻璃片之间进行，形成蛋白质分子印迹膜。丙烯酰 胺是水溶性功能单体，与蛋白质具有很好的相容性，聚合过程中不易造成蛋白质 变性，此外，丙烯酰胺的交联聚合条件温和，也适合生物大分子的分子印迹。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其步骤是：