[发明专利]用改良K-N法组份A+Ⅰ上清制备富含α1-抗胰蛋白酶组份的方法

说明书

技术领域

本发明属于血浆蛋白制备领域，具体涉及运用改良K-N法组份A+I上清制备富含α₁-抗胰蛋白酶(AAT)组分的方法。

背景技术

α₁-抗胰蛋白酶剂(Alpha-1 antitrypsin AAT)。分子由394个氨基酸组成，分子量为52000的糖蛋白，以天然有活性及变性无活性两种形式存在，由肝脏产生，主要功能为抑制胰蛋白酶和中性白细胞的弹性蛋白酶的活性，还可抑制糜蛋白酶，纤维蛋白溶酶等。为人体内功能最强大的酶抑制剂之一。AAT先天性缺乏如基因突变或后天因素如长期吸烟或细菌感染会造成AAT活性中心失活，都会导致AAT功能性不足进而造成机体蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡，肺组织抵抗弹性蛋白酶的能力下降，引起肺泡变形及末端小支气管以及下肺空间扩张等肺组织的慢性损害，会发生泡性肺气肿，慢性阻塞性肺病，成人呼吸道窘迫症，临床上一直就存在着采用AAT制剂进行替代治疗的需求。另外AAT和其他血液制品联用，如和抗凝血酶III用于弥散性血管内凝血；AAT和蛋白C联用可保护机体正常细胞和组织器官不受蛋白酶的破坏，抑制感染和炎症，维持机体内环境的稳定。由于AAT的功能及潜在价值受到临床医生越来越多的关注，被认为最有潜力的几个血液蛋白制品之一。我国人口众多，吸烟人数巨大，患肺部疾病的人不在少数，至今国内没有商品供应临床治疗需要。开发AAT能有利于宝贵的血浆资源的综合利用，极大地提升血浆蛋白生产的附加利润。因此开展AAT的研发不仅有很好的经济效益而且会有极佳的社会效益。

随着国内血浆蛋白分离技术的发展，Kistler与Nitschmann法及其改良法也广泛地为国内厂家所采用。

经典Kistler和Nitschmann法分离白蛋白流程如图1所示。

改良Kistler和Nitschmann法分离白蛋白流程如图2所示。

改良Kistler和Nitschmann法(简称改良K-N法)确实提升了主要血浆蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些问题，一些重要的血浆蛋白制品如α₁-抗胰蛋白酶等制备困难。国际上有一些厂家及研究者，如法国伯尔诺夫等Burnouf et al“Biochemical andBiological Properties of an α₁-antitrypsin Concentrate”Vox Sang52：291-297(1987)应用Kistler与Nitschmann法的组份A或组份A+I上清经层析柱进行分离纯化α₁-抗胰蛋白酶，该方法存在对设备要求较高，需要大规模的层析系统及配套设施，操作时间较长等缺陷，这是20多年以来一直困扰本领域技术人员的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用改良Kistler和Nitschmann法组份A+I上清制备富含α₁-抗胰蛋白酶组份的方法。

本发明方法的技术方案是：通过调整改良K-N法组份A+I上清的蛋白浓度、pH、乙醇浓度、电导、温度等五项参数后制备所述富含α₁-抗胰蛋白酶的组份；其中蛋白浓度：1.6g/100ml、pH：5.00～5.20、乙醇浓度：18％～25％(体积百分比，下同)、电导：7.0ms～8.5ms、温度：-4.5℃～-5.5℃。

进一步的，使用以下具体步骤制备上述富含α₁-抗胰蛋白酶的组份：

a、用pH 4.0醋酸盐缓冲液调节体积为V₀、蛋白浓度为P₀的改良K-N法组份A+I上清至pH 5.00～5.20；

b、将冷却至-4.5℃～-5.5℃的NaCl/乙醇混合液加入改良改良K-N法组份A+I上清，所使用的NaCl/乙醇混合液的体积记为V_B；V_B＝V_T-V₀；

c、确认体系的pH5.00～5.20、温度-4.5℃～-5.5℃及电导7.0ms～8.5ms，最终蛋白浓度P₁为1.6g/100ml，此时体系的总体积记为V_T；

d、将体系于温度-4.5℃～-5.5℃搅拌1小时，-4.5℃～-5.5℃静置过夜后离心，过滤收集沉淀，即得富含α₁-抗胰蛋白酶的组份；

其中：上述V0为待处理的改良K-N法组份A+I上清初始体积，单位L；