[发明专利]三尖杉离体胚培养及植株再生方法

权利要求书

1.一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述方法的具体步骤包括：

1) 取材方法：选取当年籽粒饱满的三尖杉种子，采摘后用湿布包好，置于4℃下暂存； 

2) 培养基的配制：在基本培养基为MS中分别添加生长激素：IBA、NAA、IAA、玉米素ZE或KT中的几种，分别配置成芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养基中还加入有Su为25g/L，Ag⁺为7～7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基的厚度为1.4～1.6cm；所述芽诱导培养基为：基本培养基MS中再加入： ZE 2.0 mg/L；NAA 0.1mg/L；IAA  1.0mg/L；Ag⁺ 7～7.5g/L；Su 20g/L；Ac 2～2.5 g/L；

    所述芽增殖培养基为：基本培养基MS再加入： ZE 2.0mg/L；NAA  1.0mg/L；IAA  1.0mg/L； Ag ⁺ 7～7.5g/L；Su 20g/L；Ac  2～2.5 g/L；

    所述生根培养基为：基本培养基1/2 MS再加入： NAA 0.5mg/L；IBA 1.0mg/L；KT  0.3mg/L；Ag ⁺ 7～7.5g/L；Su  20g/L；Ac ；2～2.5 g/L；

3) 材料消毒处理：将4℃下暂存的三尖杉种子用洗涤剂漂洗干净，用自来水滴冲3个小时，在超净工作台内用重量浓度为75%的酒精消毒消毒30秒钟，用0.1%升汞 HgCl₂ 消毒15分钟，无菌水冲3～4遍，消毒滤纸吸干表面水分；

4) 诱导培养：用眼科镊和手术刀在无菌的条件下取生长饱满的胚，直接接种于所述芽诱导培养基上；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；诱导培养的时间 15～20天；

5) 增殖培养：将经过步骤4)诱导培养的生长健壮的三尖杉幼苗切成带腋芽的茎段，接种在所述芽增殖培养基中，进行大量繁殖；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；增殖培养的时间 20～25天；

6) 诱导生根：将步骤5）增殖培养出来的长到3cm以上的无根幼苗单株切下，带有2～3片叶子，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；生根培养的时间 25～30天；

7) 试管苗完成：当试管苗长至3～4cm高，有2～3条形态正常的根，有完整须根，长度2～3cm时，完成三尖杉胚的离体培养及植株再生试管苗培养。

2.根据权利要求1所述的三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述步骤7）的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3～5天后打开瓶盖，3天后取出苗，洗去根部培养基，移入装有珍珠岩与土壤的质量比=1∶1混合的基质中，保湿遮阴，3周后成活率可达90%以上。

3.根据权利要求1所述的三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述培养基中Ag⁺的来源于AgNO₃。

4.根据权利要求1所述的三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述基本培养基1/2 MS是指：MS中大量元素减半，其余不变。

5.根据权利要求1所述的三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述步骤3）用的0.1%升汞配制为1克升汞加1000毫升蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的三尖杉离体胚培养及植株再生方法，其特征在于：所述步骤5）中带腋芽的茎段为带有2叶2芽的茎段。