[发明专利]三尖杉离体胚培养及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明属于三尖杉的培养技术，更具体涉及一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法。

背景技术

三尖杉属三尖杉科三尖杉属常绿乔木，为我国特有珍稀树种，共有9种，我国有8种，其 中福建省内有3种。其叶形似杉，但柔软不刺手，枝端冬芽呈三角排列，春天小枝分三又生 长，故名三尖杉。该树婆娑多姿，端庄秀丽，形态奇特，叶背有两条银白色的气孔带，微风 吹拂，银光耀眼，具有独特风姿。三尖杉木材坚实，纹理直，结构慎密，适合做高级家具和 室内装饰。其种子出油率高，可应用于工业。此外，三尖杉的根、茎、叶、皮、果中均含有 多种生物碱，特别是其中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱(简称双酯碱)对治疗血癌和淋巴肉 瘤有特殊疗效，近年来备受医学界关注。但由于三尖杉植物对环境条件要求较特殊，自然资 源稀少，加之其为雌雄异株，结实量少，分布区域比较狭窄，因此难以满足临床上日益增长 的需求和规模化生产的需要。由于三尖杉种子属于生理休眠性种子，休眠时间长达一年以上 ，致使育苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗。宁蒗县林业局 及林科所等单位开展了播种育苗方法研究，对种子进行层积催芽，提高了种子的发芽率，但 仍无法满足实际生产需要和规模化生产要求。在生产中，特别是对其进行药用价值开发时， 更不能提供大面积种植的优良纯化组培苗，因此急需成熟的组织培养技术，但在专利公开以 前没有一个有关其组织培养的报道，更没有成功的实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种三尖杉离体胚培养及植株再生的组织培养方法；解决现有技术 中三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮 苗的问题，该方法培养的芽健康、茁壮、增殖时间短、成苗移植后的成活率高，苗木成活后 生长健壮，长势良好，具有显著的经济效益。

本发明的技术内容为：三尖杉离体胚培养及植株再生方法的具体步骤包括：

1)取材方法：选取当年籽粒饱满的三尖杉种子，采摘后用湿布包好，置于4℃下暂存；

2)培养基的配制：在基本培养基为MS中分别添加生长激素：IBA、NAA、IAA、ZE(玉米 素)或KT中的几种，分别配置成芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养 基中还加入Su为25g/L，Ag⁺为7～7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基 的厚度为1.4～1.6cm；

3)材料消毒处理：将4℃下暂存的三尖杉种子用洗涤剂漂洗干净，用自来水滴冲3个小 时，在超净工作台内用重量浓度为75％的酒精消毒消毒30秒钟，用0.1％升汞HgCl₂消毒15分 钟，无菌水冲3～4遍，消毒滤纸吸干表面水分；

4)诱导培养：用眼科镊和手术刀在无菌的条件下取生长饱满的胚，直接接种于所述芽 诱导培养基上；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温 度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；诱导培养的时间15～20天；

5)增殖培养：将经过诱导培养的生长健壮的三尖杉幼苗切成带腋芽的茎段，接种在所 述芽增殖培养基中，进行大量繁殖；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培 养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；增殖培养 的时间20～25天；

6)诱导生根：将步骤5)增殖培养培养出来的长到3cm以上的无根幼苗单株切下，带有 2～3片叶子，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养 的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间14～16h/d，光照强度1500～2000 Lx；生根 培养的时间25～30天；

7)试管苗完成：当试管苗长至3～4cm高，有2～3条形态正常的根，有完整须根，长度 2～3cm时，完成三尖杉胚的离体培养及植株再生试管苗培养。

8)试管苗移栽：所述步骤7)的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下 炼苗3～5天后打开瓶盖，3天后取出苗，洗去根部培养基，移入装有珍珠岩、土壤(质量比 )1∶1混合的基质中，保湿遮阴，3周后成活率可达90％以上。