[发明专利]一种检测乳品中多种抗生素残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中兽药残留检测技术。特别是涉及在采用表面等离子体共振传感器 进行乳品中抗生素残留检测过程中的样品处理及传感器修饰方法。

背景技术

抗生素在乳制品中的残留越来越引起关注。除了一些常见的炎症疾病，奶牛尤其易患乳 腺炎，因此兽医常采用抗生素进行治疗。由于一般抗生素能耐高温，现有的加热杀菌工艺根 本无法完全消除牛奶中的抗生素残留。长期饮用含有微量抗生素的牛奶，会增加人体内细菌 的耐药性，降低或完全抵消抗生素类药物的疗效，另外，对于特定人群，含有超量抗生素的 牛奶还可能会引起抗生素过敏反应。

目前鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类，分别是：生物测定法(微生物测定法 和放射受体测定法等)、理化分析法(波谱法和色谱及联用技术等)、免疫法(放射免疫法 、荧光免疫法和酶联免疫法等)。由于生物测定法和理化分析法都具有测量程序复杂、时间 长等缺点，不适宜广泛推广，因此，一些基于免疫法的检测技术得到了快速发展，有代表性 的有酶联免疫法、免疫传感器等等。这些检测技术采用抗生素与其抗体的特异性反应，能够 快速、准确的检测出乳品中的抗生素残留，检测限达到了欧盟对乳品中抗生素残留的最高检 测限(Maxmum Residue Limit，MRL)。

这些免疫法的检测技术也存在缺点，检测用的试剂盒和传感器往往具有专一性。如在酶 联免疫试剂盒中，针对青霉素的试剂盒是无法检测其他抗生素的，因为试剂盒中的酶标抗体 只针对青霉素抗体。而在免疫传感器中，无论是直接法还是间接法，传感器上只针对待检测 的抗生素进行配体固定，对其他类的抗生素也不再适用(同类的结构相似的抗生素除外)。 因此，检测用的试剂盒和传感器作为免疫法的耗材需要量很大，而它们的成本往往都很高。 例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用的传感器芯片CM5成本为 2000多元人民币，有4个通道可以使用，最多检测4种抗生素。免疫法的耗材成本高也是其无 法广泛推广的主要原因。

在采用表面等离子体共振技术的传感器进行抗生素的检测时，有两种方法，直接法和竞 争法，这两种方法中，传感器均具有专一性。在采用直接法进行抗生素检测时，需要在传感 器表面固定相应抗生素的单克隆/多克隆抗体，当含有该抗生素的牛乳流过时，传感器对抗 生素进行吸附，光学信号发生变化，产生响应。由于抗生素的分子量很小(几百Da)，其信 号与仪器噪声水平接近，因此，一般的表面等离子体共振传感器的检测极限无法检出该信号 ，随着一些高精度仪器的发展，可以进行某些抗生素在最高限量值附近的检测，但是对于一 些限量值极低的抗生素(如，青霉素G的最高限量值为4ppb)仍然无法实现。竞争法需要在 传感器表面固定待检测的抗生素或者抗生素偶联物，在样品中加入定量的该抗生素的单克隆 /多克隆抗体进行竞争抑制，当样品流经传感器时，可以特异性的吸附未与抗生素结合的多 余抗体，由于抗体分子量很大(几万-几十万Da)，因此，检测信号很大，而多余抗体的量 也间接的反应了样品中抗生素的含量。因此，竞争法通过转换测量对象，大大增加了传感器 的响应，是被广泛采用的方法，但传感器的专一性问题仍然存在。

有文献报道，采用地高辛(digoxigenin，DIG)标记氨苄青霉素进行竞争法的检测，与本 文所述的检测方法有类似之处，但是由于DIG为小分子，采用DIG对其他抗生素进行标记几乎 很难实现，未见过标记成功的报道，而该文献也未提出将DIG标记的检测方法推广到多种抗 生素的检测。因此，采用DIG标记的方法仅限于某些特殊的可被DIG的少数抗生素。有些抗生 素可以采用生物素进行标记，但是也仅限于很少的几种抗生素。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种采用同一表面等离子体共振传感器检 测乳品中多种抗生素残留的方法，解决现有技术中传感器专一，不能测量多种抗生素的问题

本发明的技术方案为：一种采用同一表面等离子体共振生物传感器实现多种乳品中抗生 素残留检测的方法，包括以下步骤：

(1)对传感器表面进行修饰，采用分子标记物的抗体或特异性吸附蛋白进行配体固定 ；

(2)对乳品样品采取预处理，对样品中的抗生素进行两次竞争抑制，如图1所示，包括 ：

首先，向样品中加入适量的待测抗生素的单克隆/多克隆抗体进行一段时间的孵化，使 得样品中的抗生素与其抗体充分反应，其中抗体为过量；