[发明专利]基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农作物育种技术领域的检测方法，具体是一种基于SRAP(Sequence-related amplified polymorphism，序列相关扩增多态性)标记的茄子亲缘关系的检测方法。

背景技术

在农业生产中与人类经济生活密切相关的绝大多数重要农艺性状是数量性状，这些性状呈连续变异，由大量的、效应微小并且可加的基因控制，并且易受环境因素的影响。这些性状由于存在很小的差异，在亲本选配时通常凭借育种学家的田间观察，这在很大程度上限制了作物新品种选育。而分子标记技术的发明有助于理清育种材料之间的亲缘关系，大大推进了育种进程。人类遗传学家D.R.L.Botstein等于1980年首先提出了RFLP(restrictionfragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)技术即通过限制性内切酶酶切基因组DNA，然后利用同位素标记的探针与酶切产物杂交来揭示其DNA多态性。1985年，聚酶链式反应(PCR)技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。随后基于这两种技术的新型分子标记不断涌现如RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplified fragments length polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeats，简单序列重复)以及SRAP(sequence-related amplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性)。但研究表明RAPD标记需要的DNA量少，分析程序简单，但为显性标记，不能区分纯合与杂合型，且重复性差，在实际应用中也存在一定困难；RFLP标记存在需要DNA样品量大，操作程序繁琐和多态性检出率低的缺点；SSR属共显性标记，可靠性高，重演性好，分辨力强，但茄子上已经开发的SSR标记数量较少。SRAP技术由Li和Quiros于2001年发明的基于PCR的双引物分子标记系统。该技术针对基因外显子富含GC，内含子富含AT的特点，进行特殊的引物设计。其中，正向引物对外显子进行特异扩增，反向引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。由于外显子序列在不同个体中通常是保守的，由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中，从而使得扩增片段呈现多态性。正向引物5′端为一段14碱基的核心序列组成，其中前10个碱基为“填充”序列(filler sequence)，无任何特异组成，接着为CCGG序列，随CCGG之后为3个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。反向引物的组成与正向引物类似，但“填充”序列后连接的为AATT；AATT序列后为3个选择性可变碱基，位于引物3′端。由于该方法扩增片段是保守的开放阅读框架(open reading frame)区域，而且茄子遗传基础非常狭窄，于是Li，G和Sun，Z.D等开发了更多的SRAP引物。由于SRAP技术具有简单、高效、高共显性、重复性高、易测序等优点，现在已经用于甘蓝、西葫芦、野牛草、棉花等的遗传图谱构建和遗传亲缘关系分析。

经对现有技术的文献检索发现，

Karihaloo，J.L等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论与应用遗传学)1995年第6期767～770页发表了题为《Random amplified polymorphic DNA variation inthe eggplant，Solanum melongena L.(Solanaceae)》(利用RAPD技术检测茄子变异)一文，文中评述22对RAPD引物中一共扩增出130条条带，但是只有4条在栽培种中存在差异，由此说明RAPD技术在检测茄子尤其是栽培种的多态性较差；

Mace，E.S等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论与应用遗传学)1999年第34期626～633页发表了题为《AFLP analysis of genetic relationships among thecultivated eggplant，Solanum melongena L.，and wild relatives(Solanaceae)》(茄子栽培种及野生种遗传关系AFLP分析)一文，文中评述AFLP是一种有效的评价遗传亲缘关系的工具，但是AFLP技术对模板DNA要求较高，成本较高，操作步骤繁琐，不利于在实践中应用；