[发明专利]构建用于抗利什曼病和结核病的疫苗开发的DNA嵌合体

说明书

发明领域

本发明提供了新的嵌合DNA疫苗构建体，其具有一起克隆到DNA疫苗载体中的自我切割肽两侧的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的esat-6区域和杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)的驱动蛋白运动结构域区域，所述DNA疫苗载体能够在哺乳动物宿主细胞内复制。该建构体旨在用以保护抵抗利什曼病和结核病。

发明背景

在过去的100年，抗传染物的疫苗的开发和广泛使用是医学的成果之一。这些疫苗成功的原因之一是它们在诱导抗体产生(体液免疫)方面表现优异，而抗体产生是免疫保护抵抗大多数病毒和细菌的主要成分。但也有例外，包括医学上重要的细胞内生物体，如结核分枝杆菌，疟疾寄生虫，利什曼寄生虫，以及还可能包括人类免疫缺陷病毒(HIV)，其中保护更依赖于细胞介导的免疫而不是诱导出抗体(体液免疫)。

传统的有效疫苗是由灭活或减毒形式的传染物制成。也使用传染物的改良产品(类毒素)或传染物的构件(如被膜)。这些疫苗在其诱导的抗体应答方面有一定的局限性和问题。此外，当使用非活性(灭火的，减毒的生物体，类毒素或被膜)疫苗时，需要大剂量的和反复剂量的施用，并且所获得的保护性免疫并不持久。此外，制造减毒活疫苗和灭活疫苗过程会改变天然蛋白质的结构，从而降低了疫苗的抗原性，而且在大多数情况下通常产生的是体液介导的免疫反应，而不是细胞介导的免疫反应。在这种情况下需要的，但尚未实现的，是如下抗原，其使用安全，能够经内源性途径得到处理，并最终激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。这对细胞内病原体如利什曼寄生虫非常需要。以此方式产生的激活的CTL会破坏寄生虫感染的细胞。

基于上诉原因，新的疫苗接种的方法正在深入研究，其中涉及注射含有目标抗原基因的一段DNA。最近多方报道了使用DNA疫苗诱导细胞免疫应答对抗多种寄生虫，其中包括疟原虫(Plasmodium)和利什曼原虫(Leishmania)，以及对抗多种细菌病原体如人类中的分枝杆菌属(Mycobacterium spp)，这为临床应用此免疫方法带来了希望。

在DNA疫苗中，将所需的目标抗原基因(病原体来源)克隆到细菌质粒中，所述细菌质粒经改造以扩大插入基因在哺乳动物细胞中的表达。被注射到动物体内后，质粒进入宿主细胞，在细胞核内以附加体形式存在，并没有整合入宿主细胞的DNA。利用宿主细胞的新陈代谢机制，附加体上的插入克隆DNA指导其编码的抗原合成。

涉及在细胞内合成抗原的方法较使用外源重组蛋白或灭活生物体进行免疫有几个潜在的优势。由质粒转染的细胞产生的蛋白质易于折叠形成其天然构象，因此有益于产生中和抗体。此外，由质粒DNA指导合成的肽能够被运到细胞表面并被MHC I类分子展示，这是刺激CD8+细胞毒T细胞的关键步骤，从而进一步引起细胞介导的免疫。于此相反，标准疫苗抗原通过细胞吞噬或内吞作用被细胞吸收，并经MHC II类系统处理，所述MHC II类系统主要刺激抗体应答。最后，已证明DNA疫苗维持并刺激持续的免疫应答。

除了能诱导合适的免疫应答，DNA疫苗的另一个引人注目之处在于它们能确保多肽正确折叠，并长期产生和释放抗原，而且不需要佐剂。其它优点包括DNA分子稳定，保质期长，而且不需要严格的冷链物流(cold chain for distribution)。DNA疫苗也比某些活病毒疫苗更安全，尤其应用于免疫受损的患者诸如感染HIV的患者。它也绕过了传统疫苗存在的很多问题，例如对递送载体的免疫应答问题和涉及使用病毒载体的安全性问题。这些DNA疫苗还可以采用这种方式构建，即把来源于不同病原体的基因包括在同一个质粒中，从而有效地减少儿童必需的免疫接种次数。此外，在像我们这样的热带国家，人们常常患多种传染病，嵌合疫苗已成为重要的需要。

利什曼原虫和分枝杆菌都被认为是重要的人类病原体。世界卫生组织(WHO)认为利什曼病是重要的寄生虫病之一，大约3.5亿人处于感染该病的危险之中。这一疾病已遍布于全球，至少在88个国家流行，该病发生在除没有合适载体的南极洲以外的各大洲。另一方面，分枝菌感染仍然是世界范围内死亡和发病的主要原因。全球每年结核病导致2-3百万人死亡和15万个新病例，而在印度每天有超过1000人死于此。