[发明专利]使用β-丙内酯(BLP)进行最终灭活的细菌菌影(BG)生产方法

说明书

本发明涉及细菌菌影(Bacterial Ghost)制备物，其中使用β-丙内酯进行细菌的最终灭活。

革兰氏阴性菌的空的细菌细胞被膜(即所谓的细菌菌影(BG))是通过基因的受控异源表达制备的，所述基因将细菌(特别是革兰氏阴性菌)部分裂解(EP-A-0291021、EP-A-0516655)。例如，裂解基因可以是编码多肽的噬菌体PhiX174基因E，所述多肽被插入到革兰氏阴性菌的细胞被膜复合物中并导致形成跨过内膜和外膜的跨膜通道结构。该通道结构的内径在大约20-400nm的范围内(特别是40-200nm)或500-1,000nm，这取决于所用的裂解条件。细胞质成分通过该通道结构被释放，从而获得具有完整形状的空的细胞被膜复合物，即所谓的细菌菌影。

虽然产生不含细胞质成分的BG的裂解方法是非常有效的，但是，有一定数量的细胞(通常在10⁴个细胞中有至少1个)仍然是完整的。细菌裂解基因(例如噬菌体PhiX174基因E)和核酸酶基因(以产生不含核酸的细菌菌影)的受调节的共表达引起杀灭过程效率的协同性升高，从而引起BG制备物中活体细菌细胞的大量减少，如W003/006630所揭示。

在WO 91/13555和WO 93/01791中揭示了细菌菌影作为死疫苗或佐剂的用途以及在其细胞被膜结构中携带异源蛋白的重组细菌菌影的制备。细菌菌影还适合作为活性化合物的载体或靶向介质，如WO00/53163所描述。

为了使细菌菌影作为死疫苗的用途更加安全，特别是应用于人类医药，需要提供不含活体细菌细胞的BG制备物。因此，本发明要解决的技术问题是提供不含活体细菌细胞的BG制备物。

令人惊奇地发现：当杀菌剂被用作BG生产过程的最终步骤时，几乎所有的潜在未被杀灭的细菌都被灭活，其中所述杀菌剂是β-丙内酯(BPL)。更加令人惊奇的是，在β-丙内酯处理之后，细菌菌影制备物保持完整性。

β-丙内酯的化学式是C₃H₄O₂，其分子量为72.06g/mol。β-丙内酯是无色液体，在水中高度可溶，其降解产物是由于自身破坏而产生的无害化合物。β-丙内酯作为杀菌剂被用于疫苗、组织移植物、外科手术工具和血浆、水、牛奶和营养液的酶，并用作封闭空间内的水汽相消毒剂。其杀菌作用被用于对抗植物细菌、致病性真菌和病毒。

因此，本发明的第一个方面涉及几乎不含活体细菌细胞的细菌菌影的制备物，包括以β-丙内酯处理所述细菌菌影。优选地，菌影制备物中任何残余活体细菌细胞的数目被降低至少10³倍、更优选降低10⁴倍、更优选降低10⁵倍，最优选降低10⁶倍或更多。

在以上描述的方法中，优选以0.01％-1％(v/v)的终浓度，更优选以0.025-0.5％(v/v)的终浓度加入β-丙内酯。可以在一个或多个步骤中向制备物中加入β-丙内酯，例如在两个连续步骤中加入，其中两部分优选为等量的，其中在大约15-45分钟(例如大约30分钟)之后加入第二部分的β-丙内酯。优选作为液体加入β-丙内酯。作为水汽或喷雾或其它形式加入也是可以的。

本发明的优选方面在于将细菌菌影灭活10-60分钟，更优选为15-45分钟，更优选为25-35分钟。

此外，根据本发明，优选在15-55℃，更优选在26-50℃，更优选在35-45℃，更优选在36-44℃，最优选在38-43℃加入β-丙内酯。

本发明的细菌菌影制备物可以通过包括以下步骤的方法制备：

(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成通道结构的裂解蛋白的基因的细菌细胞；

(b)可选地在裂解基因不表达的条件下培养细菌细胞；

(c)将细菌细胞置于裂解基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被释放的条件；和

(d)获得所产生的细菌菌影。

编码裂解蛋白的基因的优选例子为噬菌体PhiX174基因E。

特别优选地，用于以上描述的制备细菌菌影的方法的细菌细胞另外编码能够水解细菌细胞中的细胞质成分的酶，如WO 03/006630所描述。相应的制备细菌菌影的方法包括以下的额外步骤：

(a)可选地在所述酶基因不表达的条件下培养细菌细胞；

(b)将细菌细胞置于其中所述酶基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被降解的条件。