[发明专利]生产二羧酸的方法

权利要求书

1.生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵真核细胞，其中所述真核细胞包含催化异柠檬酸向琥珀酸转化的酶，以及产生所述二羧酸，其中琥珀酸在胞质溶胶中产生。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的酶是异柠檬酸裂解酶。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的酶与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

4.任选地根据权利要求1到3中任何一项的生产二羧酸的方法，其中，所述真核细胞包含催化乙醛酸向苹果酸转化的酶，其中，苹果酸在胞质溶胶中产生。

5.根据权利要求4的方法，其中，所述的酶是苹果酸合酶。

6.根据权利要求4或5的方法，其中，所述的酶与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少40％的序列同一性。

7.根据权利要求1到6中任何一项的方法，其中，所述的真核细胞是酵母或丝状真菌，所述的酵母或丝状真菌选自由Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Trichosporon、Trichoderma、Rhizopus或Zygosaccharomyces属构成的组。

8.根据权利要求1到7中任何一项的方法，其中，从发酵液中回收所述二羧酸，并任选地，对所述二羧酸进行纯化。

9.根据权利要求1到8中任何一项的方法，还包括：从所述发酵培养基回收二羧酸是苹果酸、延胡索酸或琥珀酸。

10.根据权利要求1到9中任何一项的方法，还包括：使用生产的所述二羧酸来制备药物、化妆品、食物、饲料或化学产品。

11.真核细胞，其包含编码第一种酶的核苷酸序列和编码第二种酶的核苷酸序列，所述的第一种酶催化异柠檬酸向琥珀酸的转化，所述的第二种酶催化乙醛酸向苹果酸的转化，其中，所述的第一种酶和第二种酶在胞质溶胶中有活性。

12.根据权利要求11的真核细胞，其中，所述的第一种酶是异柠檬酸裂解酶。

13.根据权利要求11到12的真核细胞，其中，所述的第二种酶是苹果酸合酶。

14.根据权利要求11到13中的任何一项的真核细胞，其中，所述的细胞是酵母。

15.根据权利要求11到14中的任何一项的真核细胞，所述真核细胞是下述Saccharomyces cerevisiae，所述Saccharomyces cerevisiae包含编码具有异柠檬酸裂解酶活性的酶的SEQ ID NO：6的核苷酸序列和编码具有苹果酸合酶活性的酶的SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

16.真核细胞，所述真核细胞经过转化，从而能够通过在合适的发酵培养基中发酵所述细胞使得所述细胞生产二羧酸，其中，所述细胞包含催化异柠檬酸向琥珀酸转化的酶，其中琥珀酸在胞质溶胶中生产，和/或催化乙醛酸向苹果酸转化的酶，其中苹果酸在胞质溶胶中生产。