[发明专利]生产二羧酸的方法

说明书

本发明涉及生产二羧酸的方法和下述真核细胞，所述真核细胞包含催化异柠檬酸向琥珀酸转化的酶和催化乙醛酸向苹果酸转化的酶。

4碳二羧酸，苹果酸、延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体，其在药物、化妆品、食物、饲料或化学工业中有大量应用。

迄今为止，苹果酸、延胡索酸和琥珀酸主要通过(石油)化学方法生产，这些方法被认为对环境有害且昂贵。

二羧酸(如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸)的发酵生产可能是生产这些二羧酸的有吸引力的替代性方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。

已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas sp.生产琥珀酸。对这些细菌菌株的代谢工程改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或降低了副产物形成。

WO2007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母，所述酵母经丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白转化过。

尽管二羧酸的发酵生产已有所改进，但是仍然需要改进的生产二羧酸的方法。

本发明的目的是改进的生产二羧酸的方法。

该目的根据本发明通过下述生产二羧酸的方法来实现，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵真核细胞(其中所述真核细胞包含催化异柠檬酸向琥珀酸转化的酶)以及，产生二羧酸，其中二羧酸在胞质溶胶中产生。如在本文中所理解的，将异柠檬酸向琥珀酸的转化包含乙醛酸的形成。优选地，本发明方法中的真核细胞包含催化异柠檬酸向琥珀酸和乙醛酸转化的酶。

令人惊讶地，较之其中发酵不包含催化异柠檬酸向琥珀酸转化(其中琥珀酸在胞质溶胶中产生)的酶的真核细胞的方法，在根据本发明的方法中，生产了增加的量的二羧酸。

可在根据本发明的方法中生产的合适的二羧酸是选自苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的4碳二羧酸。优选地，二羧酸是延胡索酸或琥珀酸，特别是琥珀酸。

在本文中使用时，术语二羧酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、异柠檬酸和乙醛酸也包括化合物二羧酸盐/酯、苹果酸盐/酯、延胡索酸盐/酯、琥珀酸盐/酯、异柠檬酸盐/酯和乙醛酸盐/酯，即酸的离子形式和盐、酯或其醚，这些术语可互换使用。酸形式是离子形式的氢化形式，其受pH影响。

在根据本发明的方法中发酵的真核细胞可以是野生型或重组真核细胞。在本文中使用时，重组真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有天然不存在于酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质，或所述细胞经天然不存在于酵母中的核苷酸序列转化或遗传修饰过，或其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外一个或多个拷贝。通常地，本发明的真核细胞是重组真核细胞。

催化异柠檬酸盐/酯转化成琥珀酸盐/酯的酶可以是任何合适的异源酶或同源酶。优选地，酶是异柠檬酸裂解酶(EC4.1.3.1)。

术语“同源”在本文中使用时，是指在细胞或有机体、基因组、DNA或RNA序列中天然发现或对细胞或有机体、基因组、DNA或RNA序列来说内源的核苷酸(DNA或RNA)或多肽。

术语“异源”在本文中使用时，是指天然不作为有机体、细胞、基因组DNA或RNA序列的一部分存在或对有机体、细胞、基因组DNA或RNA序列来说是外源的核苷酸或多肽。

为在胞质溶胶中生产二羧酸(例如琥珀酸或苹果酸)，可能需要对催化二羧酸产生的酶定位于胞质溶胶。酶可天然存在于胞质溶胶中，或可通过缺失靶向序列(例如来自酶的过氧化物酶体(或线粒体)靶向信号)来获得胞质溶胶定位，以获得所述的酶的胞质溶胶活性。靶向信号的存在可以通过本领域内已知的方法来鉴定，例如通过Schlüter等，Nucleic acid Research 2007，Vol 25，D815-D822所公开的方法测定。过氧化物酶体靶向信号是过氧化物酶体蛋白中与受体结合的的区域，所述受体将蛋白指导至过氧化物酶体。过氧化物酶体蛋白在胞质溶胶中合成。过氧化物酶体靶向信号的缺失将会阻止过氧化物酶体靶向。

优选地，在本发明的真核细胞中表达的编码催化二羧酸产生的酶(例如，催化异柠檬酸盐/酯向琥珀酸盐/酯转化或催化乙醛酸盐/酯向苹果酸盐/酯转化的酶)的基因在存在可发酵的糖的情况下表达。

在存在可发酵的糖时，基因的表达可天然发生，或可通过对酶的葡萄糖阻遏(repression)的缺失来获得，例如通过用对葡萄糖阻遏不敏感的启动子替换对葡萄糖阻遏敏感的启动子来实现。此类启动子是本领域技术人员已知的。