[发明专利]用于通过多级萃取纯化治疗用蛋白质的方法

说明书

本发明涉及用于通过多级萃取纯化蛋白质(特别是治疗用蛋白质)的方法。

生物产品通常是通过色谱方法纯化的。其中，通常使用例如离子交换、疏水相互作用、亲和力和尺寸排阻的分离机制。然而除了高选择性的优点之外，这些技术还具有多个缺点，例如柱的复杂填充、低颗粒内扩散、在填料上的高压降、低容量、低化学和蛋白水解稳定性和吸附剂的高成本。

此处提供的一种替代方式是含水2相萃取(ATPE)。其能够同时用于从复杂混合物(例如发酵液或生物提取物)中细胞分离、浓缩和初次纯化目标组分[P.A.Albertsson，Partition of Cell Particles andMacromolecules，Wiley，New York，1986；M.Rito-Palomares，J.Chromatogr.，B807(2004)3]，因此是用于多重的从包含生物物质的混合物中分离问题的健壮(robust)纯化方法。这些分离操作的技术效果是基于特定浓度的两种聚合物或一种聚合物和一种盐的相互不相容性的。除了由于这些系统的高水含量(80～90％(w/w)水)和低表面张力造成的非常好的生物相容性之外，通常在单级方法中，通过改变实验条件(例如浓度、pH值、离子强度和该聚合物的分子量)已经能够达到特定的选择性和产率[P.A.Albertsson，Partition of Cell Particles andMacromolecules，Wiley，New York，1986]。

US 2007/0048786公开了其中通过单级或多级萃取或液液分离将蛋白质分级成多个等级的方法。该萃取例如是含水2相萃取。该方法涉及该浓缩级分的进一步分析。未公开提供可用于治疗应用品质的单一蛋白质的目的。因此所得到的级分以及该萃取方法可以描述为“粗”的。因此未公开关于用于得到纯净形式的蛋白质的教导。

US 4,728,613公开了通过其可以由啤酒发酵得到细胞外酶的方法。该方法包括将全部发酵液与聚合物和无机盐混合，由此形成含水2相体系。该目标酶在这种情况中聚集在聚合物相中。公开的可用的聚合物是聚乙二醇、聚乙二醇的胺、聚乙二醇的羧酸酯、聚丙二醇及其胺和羧酸酯、聚乙二醇酯、聚乙烯亚胺、三甲基氨基-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮及其混合物。该方法仅包括一个萃取步骤以及任选地还包括从该含水聚合物相中将该酶分离出来。该酶在得到之后的纯度仅为约90～92％。除此之外，该富含酶的相显著被5～20体积％的盐相污染。因此，该方法不适用于制备高纯度的蛋白质。

US 5,151,358以及US 5,139,943的公开内容解决了该萃取产物纯度不够的问题。两者都将第一含水2相萃取的萃取产物通过离子交换柱以得到更纯形式的目标蛋白质凝乳酶。为此接着需要必须将该蛋白质从该柱中回收，这又伴随有色谱法的上述缺点。

US 4,879,234公开了其中通过将细胞材料经过两次相继的萃取得到来自博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶的复杂方法。在第一步骤中，将包含该甲酸脱氢酶的细胞材料暴露于第一2相体系，其中该一个相包括聚乙二醇或聚丙二醇的含水溶液，该另一相包括包含作为成相剂(Phasenbilder)的葡聚糖、甲基纤维素或聚蔗糖(Ficoll)的含水相以及与聚乙二醇或聚丙二醇化学结合的三嗪染料。依照US 4,879,234，在特定时间之后，然后该甲酸脱氢酶位于上部相中。将该第一2相体系的下部相丢弃掉，并在该上部相中添加含水磷酸盐溶液，由此再次形成第二2相体系，其中依照该公开内容，然后该甲酸脱氢酶富集在该下部相中。将其从该上部相中分离出来，由此又通过例如超滤得到该甲酸脱氢酶。包括与聚乙二醇或聚丙二醇化学结合的三嗪染料的该第二步骤中的上部相能够被再利用。依照该公开内容，该第一2相体系的形成是亲和性分离系统。在各情况中两相的分离能够使用工业装置(例如喷嘴分离器或盘式分离器)进行。

US 4,879,234公开了作为在上述工序之后的单独另一分离步骤的冻干法。然而，其不适用于获得该萃取剂(特别是该化学改性的聚乙二醇或聚丙二醇)的可靠分离，这特别对于治疗用蛋白质将会是不容许的。此外，如果制备有些昂贵的该改性的聚乙二醇或聚丙二醇不能得到定量回收，该方法经济有效性的程度也存在问题。然而，定量回收在物理上是不可行的，因为在萃取方法的情况中，一相的部分永远被携带到另一相中。因此，US 4,879,234中公开的方法必须描述为对于治疗用蛋白质的应用在经济上是不利的。