[发明专利]具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属

权利要求书

1.选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的重组细菌菌株，所述重组细菌菌株包含通过转化导入的嵌合基因，所述嵌合基因包含：

a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和

b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。

2.权利要求1的重组菌株，其中所述碱基取代是：

a)在-190位，T取代G；和

b)在-89位，T取代C。

3.权利要求2的重组菌株，其中所述改善的Pgap包含选自下组的序列：SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和12。

4.权利要求1的重组菌株，所述重组菌株附加地用表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因进行了转化。

5.权利要求1的重组菌株，其中所述嵌合基因还包含可操作地连接的编码木酮糖激酶的分离的核酸分子，形成操纵子。

6.权利要求1的重组菌株，其中当使用Pfam序型HMM查询表3中给出的xylA家族蛋白时，所述木糖异构酶是具有小于或等于3×10^-10的E值参数的蛋白，并且具有四个催化位点残基：组氨酸54、天冬氨酸57、谷氨酸181、和赖氨酸183，所述位置编号是参照白色链霉菌木糖异构酶序列(SEQ ID NO：X)。

7.权利要求1的重组菌株，其中所述木糖异构酶具有的氨基酸序列与选自下组的序列具有90％的氨基酸同一性：SEQ ID NO；42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、和104。

8.对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括：

用嵌合基因进行转化，所述嵌合基因包含：

a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和

b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。

9.对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的利用木糖的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括任何顺序的下述步骤：

a)用表达转醛醇酶和转酮醇酶的基因或操纵子进行转化；和

b)用表达木糖异构酶和木酮糖激酶的基因或操纵子进行转化，其中所述木糖异构酶表达自运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子；所述启动子是改善的Pgap。

10.生产乙醇的方法，所述方法包括：

在包含木糖的培养基中培养权利要求1的重组细菌菌株；

保持在任何系统中适于乙醇生产的发酵条件，

由此促使权利要求1的培养的重组细菌菌株将木糖转化成乙醇。

11.选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的、经工程化以表达木糖异构酶的重组细菌菌株，所述木糖异构酶的表达水平为产生至少约0.1微摩尔产物/毫克蛋白/分钟，这通过使20μL细胞游离提取物在30℃下在反应混合物中反应而进行测定，所述混合物包含0.256mM NADH，50mM木糖，10mM MgSO，10mM三乙醇胺，和1U/mL山梨醇脱氢酶，其中D-木酮糖是产物。