[发明专利]具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年3月27日的美国临时申请61/039878的优先权，该申请以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。此外美国政府拥有本发明的权利，受美国能源部与美国国家可再生能源实验室即美国中西部研究所的分支机构签署的合同号DE-AC36-99GO10337的约束。

发明领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，描述了具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属(Zymomonas)菌株的基因工程化。

发明背景

通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。期望微生物能够利用木糖作为碳源来生产乙醇以及其它有用的产物，因为木糖是水解木质纤维质材料中的主要戊糖，因此能提供丰富可用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌和其它乙醇细菌天然不利用木糖，可通过导入基因将它们遗传工程化以利用木糖，导入的基因编码1)木糖异构酶，该酶催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。

已经成功地对运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株进行了工程化以用于木糖代谢(US 5514583、US 5712133、US 6566107、WO95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)，并且对棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)菌株进行了工程化以用于木糖代谢(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。然而工程化的菌株通常在木糖上生长和生产乙醇不如在葡萄糖上一样好。工程化以利用木糖的菌株已经适应在木糖培养基上连续传代，导致菌株具有如美国专利7,223,575以及共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870所述的改善的木糖利用率。然而仍未确定该改善的遗传基础。

需要具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属的遗传工程化菌株和其它乙醇细菌。申请人已经发现了工程化以利用木糖并具有改善的木糖利用率的运动发酵单胞菌菌株的遗传改变，并且使用该发现以工程化具有改善的木糖利用率的菌株。

发明内容

本发明涉及遗传工程化以利用木糖的细菌菌株，该菌株用编码木糖异构酶的嵌合基因进行转化，所述基因表达自改善的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)。该菌株也用表达木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因进行转化。改善的Pgap引起比天然Pgap更高的表达，这引起与不具有用于表达木糖异构酶的改善的Pgap的菌株相比改善的木糖利用率。

本文所描述的是重组细菌菌株，该菌株选自包含通过转化被导入的基因的发酵单胞菌属和发酵细菌属(Zymobacter)，所述基因包含：

a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和

b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。

通过上述转化步骤导入的基因可以为嵌合基因，该嵌合基因包含用于提高Pgap表达的突变。

本文也描述了对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌菌株进行工程化的方法，所述方法包括用基因如嵌合基因进行转化，所述嵌合基因包含：

a)包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有碱基取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译启始密码子；所述启动子是改善的Pgap；和

b)可操作地连接的编码木糖异构酶的分离的核酸分子。

本文描述了对选自发酵单胞菌属和发酵细菌属的利用木糖的细菌菌株进行工程化的另一种方法，所述方法包括任何顺序的下述步骤：