[发明专利]用于在化学成分确定的培养基中培养细胞的合成表面

说明书

相关申请

本申请要求2008年1月30日提交的，名为“Synthetic Surfaces forCulturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media(用于在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞的合成表面)”的美国临时申请序列号61/062,890和2008年1月30日提交的，名为“Stem Cell Article andScreening(干细胞制品和筛选)”的美国临时申请序列号61/062,937的优先权。

领域

本发明涉及细胞培养制品，更具体地说涉及用于在化学成分确定的培养基中支持未分化干细胞培养的制品。

背景

多能干细胞，如人类胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力，从而在人体中形成任何成人细胞类型。这种独特的性能为开发大量严重的细胞退化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等的新治疗方法提供了可能性。然而，开发这种hESC治疗有障碍。此类障碍包括在细胞和组织培养中获得并维持足够量的未分化hESC和控制其分化以产生特定细胞类型。干细胞培养，如hESC细胞培养通常用细胞库或细胞储备物的少量细胞接种，然后在未分化的状态下扩增直至给定的治疗用途需要分化。为达到这点，目前在有含动物衍生的成分(如滋养层、胎牛血清或MATRIGEL^TM)的表面或培养基存在下培养hESC或其分化细胞群。向培养环境添加这些动物衍生的东西使得细胞接触可能有害的病毒或其它传染性物质，这些有害的病毒或其它传染性物质会转移到患者或损害hESC的常规培养和维持。此外，此类生物产品易产生批次差异、免疫反应和存储寿命有限。

虽然目前已在动物衍生的表面上用化学成分确定的培养基，例如MATRIGEL^TM和蛋白质，例如血清蛋白或胞外基质蛋白培养未分化干细胞，但尚未鉴定到利用化学成分确定的培养基和合成的非蛋白质表面的完全不含动物产品的体系来长期培养未分化细胞。

简述

本发明描述了可用于在化学成分确定的培养基中培养包括干细胞和未分化干细胞的真核细胞的合成表面。在合成基材上培养时，未分化的干细胞可维持未分化5、7、10代或更多代。

在各种实施方式中，细胞培养制品包括具有表面的基材。将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层设置在基材表面上。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层可由包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(二-官能或更高-官能)(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体及交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层水中的平衡水含量为约5％-约70％。肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层(conjugate)。该肽含有RGD氨基酸序列。细胞培养制品可负载未分化干细胞，例如人胚胎干细胞在化学成分确定培养基中的培养和维持。

在各种实施方式中，制备细胞培养制品的方法包括将单体沉积在细胞培养制品的基材表面上。沉积在表面上的单体包括含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体和交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体。该方法还包括在基材表面上聚合单体以形成水中平衡水含量为约5％-约70％的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。该方法还包括将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层与肽结合，所述肽可以是含RGD的多肽。

与现有的用于培养干细胞，特别是未分化干细胞的表面相比，本文的一个或多个实施方式提供一种或多种优点。例如，合成表面减少与具有得自或衍生自动物来源的组分的表面相关的潜在污染问题。与含生物学组分的表面相比，此类表面还可改善储存寿命。能在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞进一步减少了潜在的污染问题。此外，合成表面或化学成分确定的培养基的工作性能在批次之间的差异可能较低，从而改善培养结果和预计的重现性。结合附图阅读时，从以下详述不难理解这些和其它优点。

附图简述

图1A-1B是涂布合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的制品的侧视图。

图2A-2C是具有孔的细胞培养制品的截面的示意图。未涂布的表面(2A)；涂布表面(2B)；涂布的表面和侧壁(2C)。

图3A是偶联于多孔板中1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。

图3B是偶联于多孔板中0.1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。

图3C显示了涂布在1微米或0.1微米厚表面上的多肽浓度与荧光强度关系图。